Приложение В (справочное). Испытание цитотоксичности дентинного барьера

Приложение В
(справочное)

Испытание цитотоксичности дентинного барьера

B.1 Цель

Испытание предназначено для оценки цитотоксичности стоматологических пломбирующих материалов методом культуры клеток, при котором клетки и материал разделены дентинным барьером, таким образом моделируя клиническую ситуацию зубной полости, наполненной восстанавливающим материалом.

B.2 Приборы и материалы

B.2.1 Клетки

Установившаяся клеточная линия, являющаяся общедоступной, например из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС). В качестве варианта могут быть использованы клональные клетки, трансфицированные большим Т-антигеном SV40, например выведенные из зубного сосочка теленка. Их поддерживают в питательной среде в увлажненной атмосфере при температуре (372)°С и 5% . Также возможно использовать другие установившиеся клеточные линии со свойствами, подобными одонтобластам, или другими свойствами, имеющими отношение к физиологии зубных пульпарных тканей.

B.2.2 Культуральная среда

Среда, указанная для выбранной клеточной линии, как приведено в Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС) или эквивалент.

Примечание - Для рекомендаций см. http://www.atcc.org. Питательная среда для клеток, трансфицированных большим Т-антигеном SV40, состоит из МЕМ с добавленными 20%-ной сывороткой зародыша теленка (FBS), 150 ME пенициллина, 150 мкг/мл стрептомицина, 0,125 мкг/мл амфотерицина Б и 0,1 мг/мл генетицина.

B.2.3 Реагенты

B.2.3.1 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ).

B.2.3.2 Антибиотики/фунгициды, пенициллин, стрептомицин, амфотерицин Б и генетицин только для клональных клеток, трансфицированных SV40.

B.2.4 Оборудование

B.2.4.1 Вкладыши для планшета для культуры клеток, например Millicell*(1).

B.2.4.2 6-луночные и 24-луночные культуральные планшетки.

B.2.4.3 Полиамидные сетки диаметром 8 мм, например Sefar*(2), ширина ячейки 150 мкм.

B.2.4.4 Двухкамерное перфузионное устройство.

Первое двухкамерное перфузионное устройство, Minucells*(3), (см. рисунок В.1) состоит из перфузионной камеры, изготовленной из поликарбоната с основой 40 х 40 мм и высотой 35 мм. Пульповая часть устройства соединена с одной стороны с емкостью с запасом культуральной среды и с другой стороны с перистальтическим насосом и сосудом для отработанной среды. Внутри опытного прибора две камеры разделены срезом дентина, закрепленным в стальном штативе (см. рисунок В.2).

Рисунок В.1 - Опытная установка для испытания цитотоксичности дентинного барьера

Рисунок В.2 - Штатив из нержавеющей стали для закрепления среза дентина и клеточной культуры в опытном приборе

Второе двухкамерное устройство, перфузионная камера Американской Ассоциации Стоматологов (ADA)*(4) (см. рисунок В.3), состоит из полупрозрачных стен, изготовленных либо из Delrin*(5), либо из Lexan*(6), оба нетоксичные. Входные и выходные клапаны являются нетоксичными игловыми отверстиями из нержавеющей стали. Маленькие уплотнительные кольца изготовлены из красного силикона (внешний диаметр 15,9 мм, внутренний диаметр 12,42 мм). Внутренний 6-миллиметровый диаметр меньшего уплотнительного кольца создает область поверхностной диффузии в 28 . Камерный отдел вмещает 0,5 мл жидкости. Этот отдел может быть сокращен наполнением камеры снизу нетоксичным поливинилсилоксановым слепочным материалом (например, Reprosil*(7), так, чтобы внутри камеры находилось материала менее чем 100 мкл.

Рисунок В.3 - Перфузионная камера ADA

B.2.4.5 Планшет-ридер, 96-луночные планшеты, длина волны 540 нм, или любой аналогичный фотометр, с требуемыми параметрами.

B.2.4.6 Срезы дентина, из дентина человека или рогатого скота.

Примечание - При применении дентина происхождением не от человека, определяют проницаемость срезов до использования для подтверждения, что он схож с дентином человека на сопоставимом уровне пульпарно-дентинного соприкосновения. Для этих целей применяют капиллярную систему [например, Flowdec*(8)].

В.3 Процедура испытания

B.3.1 Приготовление клеточной культуры

B.3.1.1 Трехмерные клеточные культуры

Трехмерные клеточные культуры рекомендуется использовать вместе с перфузионной камерой Minucells. Инкубируют полиамидные сетки в 0,1 моль/л уксусной кислоты в течение 30 мин, промывают три раза деминерализованной водой, высушивают на воздухе, покрывают фибронектином (0,03 мг/мл) и высушивают на воздухе в стерильных условиях. Помещают вкладыш клеточной культуры в каждую лунку 6-луночной планшетки вместе с 1,25 мл культуральной среды. Помещают сетки на вкладыши и засевают 20 мкл клеточной суспензии при клеток/мл. После 48 ч инкубации при температуре (372)°С и под 5% при относительной влажности (9010)% переносят сетки в 24-луночные планшетки и инкубируют (142) сут. Меняют культуральную среду три раза в неделю и переносят сетки в новую 24-луночную планшетку в конце первой недели.

B.3.1.2 Мономерные культуры

Мономерные клеточные культуры рекомендуется использовать вместе с перфузионной камерой ADA. Применяют методы, описанные в ИСО 10993-5, используя установившуюся клеточную линию, являющуюся общедоступной, например из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС).

B.3.2 Приготовление срезов дентина

B.3.2.1 Дентин человека

Выбирают некариозные свежеизвлеченные молярные зубы, удаляют инородные частицы и присоединенные мягкие ткани ручными инструментами и погружают в 70%-ный этанол по меньшей мере на 15 мин. Готовят срезы дентина путем секционирования зубов под прямым углом к их длинным осям через самую широкую часть их головок, под окклюзионной эмалью и над окклюзионными пределами пульповых камер.

B.3.2.2 Дентин животного происхождения (быка)

Выбирают целые зубы, без видимых признаков стираемости, из числа четырех средних нижних резцов убойных животных возрастом от 3 до 7 лет. Удаляют зубы, очищают от инородных частиц и присоединенных мягких тканей ручными инструментами и хранят в 0,5%-ном хлорамине или других схожих агентах до использования. Секционируют зубы вдоль их длинных осей как можно ближе кпульповой камере. Для испытания используют срезы околошеечной части зуба.

B.3.2.3 Обработка срезов дентина

Протравливают предполагаемый "пульпарный" фрагмент среза дентина 50%-ной лимонной кислоты в течение 30 с, тщательно промывают и стерилизуют либо автоклавированием (121°С; 9,6 мПа; 25 мин) в 0,9%-ном хлориде натрия, либо погружением в 70%-ный этанол на 15 мин, затем тщательным промыванием деминерализованной водой. Дентинные срезы могут храниться в 0,9%-ном растворе хлорида натрия при температуре (42)°С до трех недель. Следует убедиться в стерильности дентинных срезов с помощью микробиологической культуры испытуемой пробы из каждой партии перед использованием.

Примечание - Толщина среза дентина может различаться в зависимости от глубины клинической полости, которую испытание должно смоделировать. Срез дентина толщиной (50050) мкм представляет количество дентина, остающееся под клинической полостью средней глубины. Более тонкие срезы могут быть использованы для изображения ситуации в более глубоких клинических полостях.

Срезы дентина могут храниться в 0,9%-ном хлориде натрия до использования.

B.3.2.4 Сборка перфузии

B.3.2.4.1 Устройство Minucells

Помещают сетку с клетками в опытный прибор и вставляют срез дентина, закрепленный в штативе из нержавеющей стали.

Примечание - Подходящий штатив показан на рисунке В.2.

Опрыскивают камеры 0,3 мл среды для количественного определения (питательная среда с 6 г/л буфера HEPES) каждый час в течение 24 ч. Останавливают перфузию и помещают испытуемый материал в верхнее отделение в прямом контакте с "полостной" стороной среза дентина.

После приемлемого периода времени (например, 24 ч или 3 сут) удаляют сетку с клетками из пульповой части камеры и помещают в 48-луночные планшетки, содержащие 0,5 мл предварительно нагретого раствора МТТ (0,5 мл в питательной среде), инкубируют 2 ч при температуре (372)°С с фосфатно-буферным физраствором. Экстрагируют осадок синего формазана, используя 0,25 мл диметилсульфоксида, встряхивая планшетки при комнатной температуре 30 мин. Переносят 200 мкл этого раствора на 96-луночную планшетку и определяют абсорбцию спектрофотометрическим путем при 540 нм. Выражают результаты как процент контрольных образцов или как фотометрические показания.

Используют от пяти до 10 камер для каждого материала и контрольного образца в одном испытании и проводят каждое испытание по меньшей мере дважды.

B.3.2.4.2 Сборка перфузионной камеры ADA

Устанавливают срез дентина в устройстве перфузионной камеры. Наполняют нижнее отделение приемлемой клеточной культуральной средой (или другим экстракционным средством) и соединяют его с сосудами подачи и слива, если необходимо. Затем наполняют испытуемыми материалами. После определенного времени воздействия удаляют клеточную культуральную среду и используют ее для испытания цитотоксичности в обычных монослойных культурах, например используя синтез ДНК, митохондральную активность (анализ МТТ) или стимуляцию функций, таких как регуляция генов, в качестве биологических конечных точек.

В.4 Контрольные образцы

Используют положительный и отрицательный контрольные образцы для каждого испытуемого вещества. Положительный контрольный образец должен сократить жизнеспособность клеток примерно на 50% после воздействия в 24 ч; отрицательный контрольный образец не должен иметь никакого воздействия на жизнеспособность клеток. Примеры материалов положительного контроля*(9) приведены в таблице В.1.

Примечание - В качестве отрицательного контрольного образца приемлем гидрофобный нетоксичный поливинилсилоксановый слепочный материал. В качестве положительного контрольного образца можно использовать материалы с составами, перечисленными в таблице В.1, или эквивалентные.

Таблица В.1 - Пример материала положительного контроля

Материал	Взвешенная выборка, мг	Взвешенная выборка, %	Конечная масса, %
Порошок
Стеклянный порошок	829,000	82,90	66,30
Полиакриловая кислота	146,000	14,60	11,70
Хлорид дифенилиодония	25,000	2,50	2,00
Всего	1 000,00	100,00	80,00
Жидкость
Камфорохинон	0,625	0,25	0,05
Этил-4-диметиламинобензоат	0,625	0,25	0,05
НЕМА	187,500	75,00	15,00
Дистиллированная вода	61,250	24,50	4,90
Всего	250,000	100,00	20,00

Смешивают компоненты порошка и жидкости отдельно и затем немедленно смешивают оба компонента в пропорции 1000 мг порошка и 250 мг жидкости. Отверждают стандартным агрегатом отверждения в течении 40 с при 700 - 800 .

В.5 Оценка результатов

Не учитывают опыт, если между отрицательным и положительным контрольными образцами нет статистически значимой разницы.

В дополнение к описанной оценке следует обратиться к ИСО 10993-5 для дальнейшей информации. Оценка данных, полученных от устройства Minucells, основана на статистическом сравнении (непараметрические методы) данных испытуемого материала с данными контрольных материалов, предполагая от пяти до 10 независимых культур для каждого материала. Определяют клеточные повреждения согласно таблице В.2 и оценивают результаты согласно таблице В.3.

Включают результаты оценки в отчет об испытании.

Таблица В.2 - Оценка клеточного повреждения

Шкала	Определение оценки
0	Не отличается статистически от отрицательного контрольного образца, но отличается от положительного контрольного образца или вызывает еще меньшее клеточное повреждение, чем отрицательный контрольный образец
1	Отличается статистически как от отрицательного, так и от положительного контрольных образцов
2	Не отличается статистически от положительного контрольного образца, но отличается от отрицательного контрольного образца или вызывает еще более сильное клеточное повреждение по сравнению с положительным контрольным образцом

Таблица В.3 - Оценка испытуемого материала

	Шкала	Описание
	0	Не цитотоксичный
	1	Умеренно цитотоксичный
	2	Значительно цитотоксичный

В.6 Отчет об испытании

Отчет об испытании должен включать следующую информацию:

a) использованную клеточную линию;

b) использованную культуральную среду;

c) подробности испытуемого материала;

d) подробности приготовления испытуемого материала;

e) подробности положительного и отрицательного контрольных образцов;

f) процент жизнеспособности клеток по сравнению с отрицательным контрольным образцом;

g) результаты оценки.