Приложение В (справочное). Рекомендации по исследованию уничтожения и/или дезактивации вирусов

Приложение В
(справочное)

Рекомендации
по исследованию уничтожения и/или дезактивации вирусов

В.1 Общая часть

Предполагается, что уничтожение и/или дезактивация вирусов будут следовать вероятностной концепции, и, следовательно, невозможно гарантировать полное отсутствие контаминации в изделиях.

Все испытания страдают от присущей ограниченности количественных вирусных проб, когда способность выявить низкие концентрации вирусов зависит по статистическим причинам от размеров образца (см. приложение G).

Установление отсутствия значимых вирусов в/или на ткани должно быть основано не только на результатах прямого теста на их наличие, но также на демонстрации того, что производственные ступени способны их дезактивировать или удалить.

В.2 Выбор вирусов

В.2.1 Выбор вирусов, используемых для исследования уничтожения и/или дезактивации, является критическим моментом.

По возможности необходимо выбрать значимый вирус. Если использование значимых вирусов не демонстрирует широкий диапазон свойств, где требуется, то подтверждение должно быть проведено с модельными вирусами.

В.2.2 Вирусные модели для исследований уничтожения и/или дезактивации должны быть выбраны таким образом, чтобы представить, насколько возможно, точно соответствующие вирусы, которые могут инфицировать изделие, и представить, насколько возможно, широкий диапазон физико-химических свойств для испытания способности процесса дезактивировать вирусы. На выбор модельных вирусов также должны влиять качество и свойства исходного материала и производственный процесс.

В.2.3 Если не обосновано иначе, при наличии двух возможных вирусов для исследования уничтожения и/или дезактивации конкретной ступени либо по причине их равного сходства с возможными контаминантами или сходных физико-химических свойств необходимо выбрать более стойкий.

Примечание - Хотя исходный материал не обязательно является носителем конкретных модельных вирусов, показатели сокращения, полученные для таких вирусов, предоставляют полезную информацию об общей способности производственного процесса уничтожать и/или дезактивировать вирусы.

В.2.4 Необходимо учитывать продолжающуюся восстанавливаемость модельного вируса в течение исследования дезактивации.

В.2.5 По возможности выбор вирусов должен быть таким, чтобы вирусы могли быть выращены до высокого титра.

В.2.6 Необходимо наличие эффективной, чувствительной и надежной пробы для обнаружения избранных вирусов до и после прохождения производственной ступени.

В.2.7 Необходимо учитывать опасность для здоровья сотрудников, выполняющих исследования подтверждения, которую могут представлять определенные вирусы, а также использование уместных мер защиты.

В.2.8 Примеры модельных вирусов, использованных или рекомендованных для использования в исследованиях подтверждения дезактивации, приведены в таблице В.1.

В.3 Разработка и возможные последствия исследований уничтожения и/или дезактивации

В.3.1 Общая часть

Исследования уничтожения и/или дезактивации состоят в преднамеренном введении (специальном добавлении) известного вирусного титра в различные производственные стадии и измерении степени дезактивации в течение последующей отдельной производственной стадии или стадий. Утверждение каждой отдельной производственной стадии производственного процесса не является необходимым. Только те производственные стадии, которые вероятно или потенциально могут способствовать уничтожению и/или дезактивации вирусов, должны являться предметом изучения уничтожения и/или дезактивации. В случаях, когда процесс включает в себя несколько производственных ступеней с низким коэффициентом сокращения в каждой, может быть необходимым утверждение процесса в целом (см. В.3.5).

Необходимо тщательно рассмотреть точное определение отдельной производственной стадии.

Необходимо избегать намеренного внесения любого вируса на производственный объект. Подтверждение должно быть проведено в отдельной лаборатории, оборудованной для таких целей, обычно на уменьшенной версии производственного процесса, и выполнено соответственно компетентными и опытными сотрудниками. Для рекомендаций по уменьшению см. приложение D.

В.3.2 Разработка исследования

В.3.2.1 Исследование должно быть разработано таким образом, чтобы наличие вирусов определялось количественным методом с учетом пределов чувствительности проб (см. приложение G).

В.3.2.2 Действенность дезактивации/уничтожения вирусов будет зависеть от структуры, размеров и формы материала и от их распределения в нем. Исследование должно быть разработано с учетом этого.

В.3.2.3 Количество вируса, добавленного в исходный материал для изучаемой ступени производства, должно быть максимально высоким в целях адекватного определения возможностей производственной ступени. Тем не менее, объем добавленной взвеси, содержащей вирус, не должен превышать 10% общего продукта, подвергаемого специальному добавлению, так что исследуемый образец остается композиционно сходным с производственным материалом. Вычисленные коэффициенты сокращения должны быть основаны на вирусе, обнаруживаемом в исходном материале со специальным добавлением, а не на количестве добавленного вируса.

В.3.2.4 Если возможно, вирус в образцах из модельных экспериментов должен быть титрован без дальнейших манипуляций, таких как ультрацентрифугирование, диализ или хранение. В случаях, когда дальнейшая обработка неизбежна, например для удаления или нейтрализации ингибиторов или токсичных веществ, или для хранения на определенный период для того, чтобы все образцы были титрованы вместе, необходимо выбрать соответствующие контрольные образцы для определения эффекта процедур на результате исследования, например эффекта разбавления. Влияние образца на систему обнаружения, включая токсические эффекты, необходимо зарегистрировать, так как оно влияет на пределы обнаружения. Хранение вирусов и образцов с добавленным вирусом следует проводить при заявленных условиях.

В.3.2.5 Когда это возможно, необходимо получить кинетику дезактивации вирусов для измерения угла наклона кривой и определения теоретического времени, необходимого для дезактивации всей популяции вирусов.

Исследования дезактивации следует планировать таким образом, чтобы пробы забирались в разное время, позволяя построить график дезактивации. Часто дезактивация вируса имеет быструю начальную фазу, за которой следует более медленная фаза. Изучение второй фазы особенно важно для определения характеристик процесса дезактивации (см. В.4.1).

В.3.2.6 В случае уничтожения, т.е. снижения инфицированности вируса путем разделения на преципитаты или удаления определенных фракций, удаленный образец также должен быть изучен. Необходимо составить баланс распределения вируса в различных фракциях, когда это возможно.

В.3.2.7 Метод пробы количественной инфицированности вирусов должен иметь адекватную чувствительность и воспроизводимость и быть проведен с достаточными репликами и контрольными образцами для гарантии адекватной статистической точности результата (см. приложение Е).

В.3.2.8 Достоверность достигнутого сокращения логарифма должна быть установлена исследованием эффекта колебания в критических параметрах процесса, использованных для установления пределов внутри процесса.

В.3.3 Выращивание вирусных моделей

Модели вирусов, используемые для утверждения процесса дезактивации, предпочтительно должны быть созданы в клеточных культурах, когда таковые доступны. Выбранная система клеточной культуры не должна изменять свойства модельного вируса.

В.3.4 Проведение исследований в клеточных культурах

В.3.4.1 Модели вирусов, используемые для подтверждения процессов дезактивации, предпочтительно должны быть испытаны в клеточных культурах. Необходимо использовать модель пермиссивной клетки для испытания потенциала к дезактивации различных производственных ступеней.

До оценки вирусных титров после дезактивации сначала необходимо оценить наличие какой-либо токсичности дезактивационных агентов или проб процесса на системе клеточной культуры, используемой для выращивания вируса. Обычно образцы должны быть нейтрализованы или разведены до нетоксичной дозы для анализа в системах клеточных культур.

В.3.4.2 Внутриклеточные вирусы обычно сложнее дезактивировать, чем внеклеточные. Подход с использованием пермиссивной клетки позволяет провести испытание действенности параметров обработки при дезактивации как внутриклеточных, так и внеклеточных вирусов.

В.3.4.3 Испытание следует продолжать до прекращения извлечения вирулентных вирусов из клеточных культур, инфицированных избранными модельными вирусами. По возможности необходимо в определенной степени провести пробы антител или иного фактора интерференции в природном агенте на образцах, все агенты которых были предположительно удалены или дезактивированы. В некоторых случаях невозможно отделить эффект дезактивации от эффекта интерференции.

В.3.5 Коэффициенты сокращения

В.3.5.1 Задачей исследования является установление ступеней, эффективных для дезактивации и/или уничтожения вирусов и для измерения общей способности производственного процесса к их дезактивации/удалению. Общий коэффициент сокращения обычно выражают как сумму индивидуальных факторов. Тем не менее, простое суммирование отдельных коэффициентов сокращения может не являться обоснованным, особенно в случаях вирусов, свойства сопротивляемости которых не изучены полностью. Сокращения в вирусном титре в течение стадии процесса порядка менее чем одного логарифма считаются незначительными и должны быть проигнорированы. Изготовители должны отличать действенные стадии от стадий процесса, которые могут способствовать удалению, но которые не настолько надежны. Также необходимо рассмотреть, будут ли вирусы, уцелевшие после одной стадии, устойчивыми в последующей стадии, либо более уязвимыми. Как правило, отдельная стадия со значительным эффектом дает лучшую гарантию снижения риска, чем несколько стадий с тем же общим эффектом.

В.3.5.2 Для всех вирусов изготовители должны обосновать приемлемость полученных коэффициентов сокращения. Необходимо принять во внимание, где применимо, общее испытание производственного процесса для обоснования общей способности процесса по отношению к дезактивации и/или уничтожению вирусов (испытание изделия после прогона процесса, следуя за добавлением к исходному материалу дозы с максимальной контаминацией).

В.4 Ограничения исследования уничтожения и/или дезактивации

В.4.1 Исследования уничтожения и/или дезактивации способствуют применению контроля риска для обеспечения приемлемого уровня безопасности медицинского изделия. Тем не менее, ряд факторов в разработке и выполнении исследований уничтожения и/или дезактивации может привести к неверной оценке способности процесса уничтожать и/или дезактивировать вирусы. Эти факторы включают следующее:

a) Разные лабораторные штаммы вируса могут иметь различную чувствительность к той же обработке.

b) Когда вирусные препараты, используемые для утверждения ступени уничтожения и/или дезактивации, создаются в тканевой культуре, поведение вируса, полученного из тканевой культуры, в исследовании уничтожения и/или дезактивации может отличаться от поведения природного вируса (например, если природный и выращенный вирусы различаются по чистоте или степени накапливания).

c) Способность всего процесса к сокращению инфицированности часто выражается как сумма логарифма сокращений каждой стадии. Это является удобным способом вычисления общего коэффициента сокращения, хотя существуют определенные ситуации, где прибавление логарифмических сокращений может не быть действительным (например, где сокращение зависит от адсорбции вируса матрицей).

d) Дезактивация вирулентности вируса часто следует за двухфазной кривой, при которой за быстрой начальной фазой следует более медленная. Возможно, что вирусы, уцелевшие после конкретной стадии дезактивации, могут быть более стойкими в последующих стадиях. Как следствие, общий коэффициент сокращения необязательно является суммой коэффициентов сокращения, вычисленных для каждой отдельной стадии с использованием каждый раз свежего инокулята вируса.

e) Например, если стойкая фракция принимает форму вирусных накоплений, вирулентность может быть устойчивой к ряду различных обработок, таких как фиксация и стерилизация.

f) Если кривая дезактивации нетипична по сравнению с существующими данными, необходимо рассмотреть это особенно и объяснить.

g) Выражение коэффициентов сокращения как логарифмических сокращений в титре подразумевает, что, хотя остаточная инфицированность вируса может быть значительно сокращена, она никогда не будет равняться нулю.

В.4.2 Существует вероятность, что обработка в уменьшенном масштабе будет отличаться от полномасштабной обработки, несмотря на усилия, направленные на создание процесса в уменьшенном масштабе (см. приложение D).

В.4.3 При определенных обстоятельствах в материале могут находиться антитела или другие молекулы, противо/взаимодействующие с вирусной моделью. Это может повлиять на разделение вирусной модели или ее подверженность дезактивации, но также может усложнить план исследования нейтрализацией вирулентности. Может быть сложно оценить пригодность плана исследования. Уровень антител в наличии может быть рассмотрен как значительная переменная процесса.

По применимости следует провести какую-то степень пробы антител или другого молекулярного противо/взаимодействия с модельным вирусом на образцах, где ожидается, что все модельные вирусы были удалены или дезактивированы.

В некоторых случаях невозможно отделить эффект дезактивации от эффекта противо/взаимодействия.

В.4.4 Небольшие различия в производственных параметрах, таких как белковое содержание или температура, могут привести к большим отличиям в сокращении вирулентности вируса каким-либо механизмом.

Таблица В.1 - Примеры вирусов, использованных в вирусных валидационных исследованиях

Вирус	Семейство	Естественный носитель	Вид	Геном	Обернутый	Размер, нм	Форма	Сопротивляемость физико-химической обработке
Полиовирус, Sabin тип 1	Picorna	Человек	Энтеровирус	РНК	Нет	От 25 до 30	Икосаэдрическая	Средняя
Вирус энцефаломиокардита (ЕМС)	Picorna	Мышь	Кардиовирус	РНК	Нет	От 25 до 30	Икосаэдрическая	Средняя
Реовирус 3	Reo	Различные	Ортореовирус	РНК	Нет	От 60 до 80	Сферическая	Средняя
SV 40	Papova	Обезьяна	Полиомавирус	ДНК	Нет	От 40 до 50	Икосаэдрическая	Очень высокая
Парвовирусы (собачьи, свиные)	Parvo	Собаки Свиньи	Парвовирус	ДНК	Нет	От 18 до 24	Икосаэдрическая	Очень высокая
Вирус лейкемии мышей (MulV)	Retro	Мышь	Тип С Онковирус	РНК	Да	От 80 до 110	Сферическая	Низкая
Вирусная диарея крупного рогатого скота (BVDV)	Toga	Крупный рогатый скот	Пестивирус	РНК	Да	От 50 до 70	Плеосферическая	Низкая
Вирус иммунодефицита человека	Retro	Человек	Лентивирус	РНК	Да	От 80 до 100	Сферическая	Низкая
Вирус везикулярного стоматита	Rhabdo	Лошади Коровы	Везикулевирус	РНК	Да	70 x 175	Палочковидная	Низкая
Гепатит А	Picorna	Человек	Гепатовирус	РНК	Нет	От 25 до 30	Икосаэдрическая	Высокая
Вирус парагриппа	Paramyxo	Различные	Парамиксовирус	РНК	Да	От 100 до 200	Плеосферическая	Низкая
Вирус синдбис	Toga	Человек	Альфавирус	РНК	Да	От 60 до 70	Сферическая	Низкая
Вирус псевдобешенства	Herpes	Свиньи	Varicellovirinae	ДНК	Да	От 120 до 200	Сферическая	Средняя
Примечание - В данной таблице приведен неполный список вирусов, использованных в исследованиях уничтожения и/или дезактивации либо в качестве значимых агентов, т.е. агентов, рассматриваемых как потенциальные контаминанты исходного материала либо как модельные агенты. Как следствие, использование любого вируса из таблицы не является обязательным, и изготовители могут рассмотреть другие вирусы, особенно такие, которые могут быть более подходящими для их конкретных производственных процессов. Необходимо учитывать опасность для здоровья сотрудников, выполняющих исследования утверждения, которую могут представлять определенные вирусы, а также использование уместных мер защиты.