Приложение А (обязательное). Методы экстракции ДНК

Приложение А
(обязательное)

Методы экстракции ДНК

А.1 Получение применимой для ПЦР ДНК методами экстракции ДНК на основе фенола/хлороформа

А.1.1 Основной метод на основе фенола/хлороформа

А.1.1.1 Общие положения

Настоящий метод является общепринятым (см. [5]) и применяется для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. А.1.1.8).

Фенол обычно подходит для деструкции нуклеаз и денатурации белка.

При исследовании листьев или зеленой массы растений (например, листьев цикория, высушенной люцерны) вместе с ДНК могут совместно осаждаться многие ингибиторы ПЦР По этой причине могут возникнуть трудности, связанные с воспроизводимостью получения ДНК, амплифицируемой в ПЦР

С учетом агрессивных и опасных свойств фенола в качестве альтернативы целесообразно применять методы экстрагирования ДНК, основанные на ЦТАБ и/или поливинилпирролидоне (ПВП) и/или на адсорбции диоксидом кремния.

А.1.1.2 Статус валидации

Этот метод широко применяется во всех областях биологии, агрономии и медицины на протяжении 40 лет, однако он никогда не подвергался оценке путем межлабораторных исследований для обнаружения ГМО в пищевых продуктах.

А.1.1.3 Принцип метода

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и последующее удаление загрязняющих примесей (например, липофильных молекул, полисахаридов и белков) и нуклеаз из водной фазы, содержащей ДНК, с помощью фенола и хлороформа. Заключительное осаждение этиловым спиртом концентрирует ДНК и удаляет соли и остаточный хлороформ. Критическим этапом метода является стадия лизиса [5].

А.1.1.4 Меры предосторожности

Работы с органическими реактивами необходимо выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.1.5 Реактивы

А.1.1.5.1 Этиловый спирт (), 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, .

А.1.1.5.3 Калия ацетат, .

А.1.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.1.1.5.5 Изоамиловый спирт .

А.1.1.5.6 Фенол, .

А.1.1.5.7 Хлороформ, .

А.1.1.5.8 Трис(оксиметил)аминометан (Трис), .

А.1.1.5.9 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевая соль (ЭДТА), .

А.1.1.5.10 Калия гидроксид, КОН.

А.1.1.5.11 Калия хлорид, KCI.

А.1.1.5.12 Натрия додецилсульфат (SDS), .

А.1.1.5.13 Протеиназа К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата,

А.1.1.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, очищенная от ДНК, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

А.1.1.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. рН

Используется фенол, уравновешенный буфером для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18), без SDS, или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.1.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.1.5.7) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.1.5.5).

А.1.1.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть уравновешенного фенола (А.1.1.5.15) и одну объемную часть смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.16).

А,1.1.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса

Молярные концентрации компонентов; Трис = 0,050 , ЭДТА = 0,050 ; массовая концентрация SDS = 30 . Доводят рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или КОН.

А.1.1.5.19 Буфер ТЕ, Трис = 0,010 , ЭДТА = 0,001 .

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или КОН.

А.1.1.5.20 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, 20 .

Автоклавирование раствора не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.1.5.21 Раствор рибонуклеазы-А, 10 лиофилизата

Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.1.5.22 Раствор этилового спирта, , 70%-ный.

Следует хранить при температуре минус 20°С.

А.1.1.5.23 Раствор ацетата калия, (), 3

Доводят значение рН до 5,2 ед. рН ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование раствора не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А.1.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.1.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 10000 g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.1.6.2 Водяная баня или инкубатор с рабочим диапазоном температур от 60°С до 70°С.

А.1.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

А.1.1.6.5 Встряхиватель, например Vortex*(1).

A.1.1.6.6 Реакционные сосуды, способные выдержать заморозку в жидком азоте.

А.1.1.7 Методика

А.1.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера анализируемой пробы необходимо соответственно скорректировать массы и объемы реактивов и буферных растворов.

А.1.1.7.2 Методика выделения

Взвешивают 0,25 г анализируемой пробы в микропробирке. Добавляют 1,6 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.1.5.18) и в случае необходимости (например, для проб с высоким содержанием белка) 50 раствора протеиназы-К (А.1.1.5.20). Инкубируют при температуре от 60°С до 70°С, обычно в течение от 30 мин до 2 ч (также возможно инкубирование в течение ночи). Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 . Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 30 мин. Извлекают образовавшийся верхний слой (супернатант) и переносят в чистую пробирку. Добавляют к нему один объем уравновешенного фенола (А.1.1.5.15), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000g в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавляют к верхнему слою один объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.17), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000g в течение 15 мин, переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. В зависимости от состава анализируемой пробы (продукта) данную процедуру повторяют один или несколько раз до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой.

Добавляют к верхнему слою один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.1.5.16), затем осторожно и тщательно перемешивают. Центрифугируют при ускорении 5000 g в течение 10 мин и переносят верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Повторяют до тех пор, пока граница раздела фаз не станет четкой. Смешивают образовавшийся верхний слой с 0,1 объема раствора ацетата калия (А.1.1.5.23) и 2,5 объема 96%-ного этилового спирта (А.1.1.5.1), затем тщательно перемешивают, переворачивая пробирки. Выдерживают в течение по меньшей мере 5 мин в жидком азоте или 1 ч при температуре минус 80°С, или всю ночь при температуре минус 20°С. Центрифугируют при ускорении 10000g (или до 13000g) при температуре 4°С в течение по меньшей мере 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой.

Тщательно промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами 70%-ного раствора этилового спирта (А.1.1.5.22). Центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g при температуре 4°С в течение 15 мин, затем осторожно сливают образовавшийся верхний слой. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Высушивают осадок в пробирке после центрифугирования и повторно растворяют его в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.1.5.19). Полученный раствор представляет собой основной раствор ДНК. Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.1.5.21) до конечной массовой концентрации 0,1 .

А.1.1.8 Перечень примеров

Описанный метод был успешно применен для экстрагирования ДНК*(2) из следующих продуктов: квашеные соевые бобы*(2), обезвоженная люцерна, детское сухое печенье*(2), детское молоко*(2), бактерии и их споры, семена ячменя, говяжий/свиной паштет*(2), пиво*(2), "голубой сыр", шоколадное пирожное с орехами*(2), консервированная кукуруза, семена моркови, брикетированный зерновой концентрат*(2), сыр, наггетсы куриные, листья цикория, корни цикория, печенье, глазированное шоколадом *(2), шоколадная паста*(2), печенье с корицей*(2), компоты, кукурузные хлопья*(2), дробленый рис, десертный крем*(2), высушенные семена гороха, кукурузное печенье, кормовой кукурузный жмых, кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм, семена кукурузы, гранулированный корм из маниоки, мясо в муке из маниоки, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке*(2) (говядина, свинина, курица и индейка), мякоть дыни, семена дыни, рубленое мясо, ингредиенты мюсли, мюсли*(2), побеги золотистой фасоли*(2), семена овса, клубни картофеля, кормовой рапсовый жмых, "глупаколца", семена рапса, колбаса (реализуемая в ломтиках*(2) и комбинированная*(2) (см. А.1.2 для усовершенствованного метода экстракции ДНК), шницель, суповые шарики, соевый белок в мясных продуктах*(2), соевый лецитин (необработанный коричневый и желтый рафинированный*(2)), побеги сои*(2), соевые напитки, соя, соевый крем, кормовой соевый жмых, соевый творог, соус для спагетти*(2), семена полбы, сахарная свекла (сушеный жом), сахарная свекла (свежие корнеплоды), семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, тофу (японский соевый творог), свежие томаты, томатная паста*(2), семена томатов, вегетарианский гамбургер, вафли (с шоколадом*(2) и без шоколада*(2)), пшеничные отруби, пшеничная мука, глютеновый корм из пшеницы, семена пшеницы, крупка из твердой пшеницы, йогурт*(2) (см. А.1.3 для усовершенствованного метода экстрагирования).

А.1.2 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур колбас, подвергаемых ферментации

А.1.2.1 Общие положения

Этот метод предназначен для экстракции суммарной ДНК, включая бактериальную геномную ДНК, из колбас. Применимость метода для получения ДНК высокого качества, пригодной для специфического обнаружения рекомбинантной ДНК с использованием ПЦР, была продемонстрирована на колбасах, подвергнутых ферментации [6], а также на колбасах, подвергнутых ферментации и термической обработке, так называемых "летних колбасах" [7]. Кроме того, было показано, что настоящий метод экстракции пригоден для выделения суммарной ДНК из сливок специально для обнаружения Staphylococcus aureus в этом пищевом продукте [8]. (Перечень продуктов, для которых применим этот метод, приведен в А.1.2.8).

А.1.2.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании проб массой 0,4 г (см. А.1.2.9).

А.1.2.3 Принцип метода

Метод заключается в выделении бактериальных клеток из пищевого продукта путем гомогенизации проб колбас с последующим центрифугированием. Полученный осадок содержит не только бактериальные клетки, но также и частицы мяса. Для проведения специфического лизиса бактериальных клеток их оболочки расщепляют, добавляя лизоцим. Для улучшения расщепления клеточных оболочек молочнокислых бактерий может быть добавлен мутанолизин. Полный лизис клеток происходит при добавлении детергента SDS (додецилсульфата натрия) и протеиназы-К, а затем несколько раз проводится экстрагирование водной фазы фенолом и/или хлороформом. Стадия экстрагирования фенолом/хлороформом является важной для устранения любой нуклеазной активности и ингибиторов ПЦР, включая те, которые возникли из пищевого продукта (например гематина). Последним этапом является осаждение ДНК этиловым спиртом.

А.1.2.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.2.5 Реактивы

А.1.2.5.1 Изопропанол [].

А.1.2.5.2 Этиловый спирт, , 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.2.5.3 Ледяная уксусная кислота, .

А.1.2.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.1.2.5.5 Натрия гидроксид, NaOH.

А.1.2.5.6 Изоамиловый спирт

А.1.2.5.7 Фенол, .

А.1.2.5.8 Хлороформ, .

А.1.2.5.9 Трис (оксиметил) аминометан (Трис), .

А.1.2.5.10 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль, (ЭДТА), .

А.1.2.5.11 Натрия додецилсульфат (SDS), .

А.1.2.5.12 Лизоцим

50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать = 0,001 в минуту при 6,24 ед. рН и температуре 25°С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 реакционной смеси при длине оптического пути 1 см).

А.1.2.5.13 Сахароза, .

А.1.2.5.14 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.1.2.5.15 Натрия ацетат ().

А.1.2.5.16 Уравновешенный фенол

Используют фенол, уравновешенный буферным раствором Трис/HCI (> 7,8 ед. рН) или приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.2.5.17 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.2.5.8) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.2.5.6).

А.1.2.5.18 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей уравновешенного фенола (А.1.2.5.16) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.2.5.8) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.2.5.6).

А.1.2.5.19 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 мутанолизина

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.1.2.5.20 Раствор лизоцима в стерильной воде концентрацией 10

А.1.2.5.21 Раствор сахарозы, , 400 .

А.1.2.5.22 Буферный раствор А, (Трис) = 0,020 , (ЭДТА) = 0,020 , (NaCI) = 0,1

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.1.2.5.23 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий одну объемную часть буфера А (А.1.2.5.22) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.2.5.21).

А.1.2.5.24 Раствор SDS, (SDS) = 250 .

А.1.2.5.25 Раствор протеиназы-К концентрацией 20

А.1.2.5.26 Раствор этилового спирта, , 70%-ный

Следует хранить при температуре и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.2.5.27 Раствор натрия ацетата, концентрацией 3

Доводят значение рН до 5,2 единиц ледяной уксусной кислотой.

А.1.2.5.28 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 , (ЭДТА) = 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя НСl или NaOH.

А.1.2.6 Оборудование

А.1.2.6.1 Инструменты для измельчения пробы (например, скальпель).

А.1.2.6.2 Центрифуга, поддерживающая ускорение, как минимум, 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.2.6.3 Водяная баня или инкубатор.

А.1.2.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.2.6.5 Смеситель, например, Vortex.

А.1.2.7 Методика

А.1.2.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массу реактивов и объемы буферов.

А.1.2.7.2 Приготовление пробы

Измельчают колбасу, гомогенизируют и добавляют к 200 - 500 мг гомогената три объема воды (до 1,5 ). Выдерживают при комнатной температуре приблизительно 10 мин.

А.1.2.7.3 Методика выделения ДНК

Осторожно переносят 500 водной фазы (суспензии) в новую пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g.

Надосадочную жидкость отбрасывают и повторно растворяют осадок в 500 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.2.5.23).

Добавляют 50 раствора лизоцима (А.1.2.5.20). Инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, можно добавить к лизоциму 10 ед. мутанолизина (А.1.2.5.19). Однако перед систематическим применением необходимо проверить специфичное для продукта воздействие этой добавки.

Добавляют 25 раствора SDS (А.1.2.5.24) и 25 раствора протеиназы-К (А.1.2.5.25), затем инкубируют в течение 10 мин при температуре 60°С.

Добавляют один объем смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.2.5.18) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку.

Добавляют один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.2.5.17) и перемешивают.

Центрифугируют смесь в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю фазу в новую пробирку.

Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.2.5.27) и один объем изопропанола (А.1.2.5.1). Осторожно перемешивают несколько раз путем переворачивания пробирки.

Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость удаляют.

Осадок после центрифугирования тщательно промывают не менее 500 раствора этилового спирта (А.1.2.5.26), осторожно перемешивают, несколько раз переворачивая пробирку. Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Эта стадия является особенно важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.2.5.28). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.2.8 Перечень примеров

См. таблицу А.1.

Таблица А.1 - Перечень продуктов, к которым был успешно применен данный метод

Успешно проанализированный продукт	Микроорганизм	Ссылка
Колбаса, подвергнутая ферментации	Lactobacillus curvatus	[6]
"Летняя колбаса" (обработанная термически)	Lactobacillus curvatus	[7]
Сливки	Staphylococcus aureus	[8]

A.1.2.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения, приведенные в таблице А.2, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [6].

При проведении этого исследования два образца дали ложноположительные результаты, вызванные, возможно, недостатками упаковки. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

Таблица А.2 - Данные эффективности применения метода

Количество участвующих лабораторий	Количество образцов колбасы на лабораторию	Общее количество образцов	Количество корректно идентифицированных образцов
15	10	150	148

А.1.3 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для заквасочных культур йогурта

А.1.3.1 Общие положения

Настоящий метод описывает процедуру экстрагирования основной массы ДНК из заквасочных культур, используемых для ферментации йогурта из молочных продуктов. Эта методика успешно применяется для обычных йогуртов, включая йогурты, содержащие различные ингредиенты, такие как фрукты, добавки и стабилизаторы, а также для продуктов с различным содержанием жира (см. А.1.3.8 и [9] - [11]). Из йогуртов, подвергнутых термической обработке [12], также экстрагируется ДНК, пригодная для ПЦР.

А.1.3.2 Статус валидации

Этот метод был проверен при межлабораторном исследовании (см. А.1.3.9).

А.1.3.3 Принцип метода

Этот метод основывается на способе выделения ДНК с помощью фенола/хлороформа, который адаптирован к специальному пищевому продукту. Грамположительные заквасочные культуры йогуртов концентрируются после расщепления коагулированного казеина при щелочном рН. Выделенные клетки повторно суспендируют в буферном водном растворе и обрабатывают лизоцимом (и мутанолизином) для расщепления клеточных оболочек. Лизис клеток происходит при добавлении ионного детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS). Белки удаляют путем обработки протеиназой-К, а затем экстрагируют смесью фенол - хлороформ и хлороформом в несколько стадий. Последней стадией является осаждение ДНК этиловым спиртом.

А.1.3.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.3.5 Реактивы

А.1.3.5.1 Изопропанол [].

А.1.3.5.2 Этиловый спирт, , 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.3.5.3 Ледяная уксусная кислота, .

А.1.3.5.4 Хлорид натрия, NaCl.

А.1.3.5.5 Цитрат натрия, .

А.1.3.5.6 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.1.3.5.7 Гидроксид натрия, NaOH.

А.1.3.5.8 Изоамиловый спирт .

А.1.3.5.9 Фенол, .

А.1.3.5.10 Хлороформ, .

А.1.3.5.11 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.1.3.5.12 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.1.3.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.1.3.5.14 Лизоцим, 50000 ед./мг белка (1 ед. будет давать = 0,001 в минуту при 6,24 ед рН и температуре 25°С, используя суспензию Micrococcus lysodeikticus в качестве субстрата, в 2,6 реакционной смеси при оптической длине пути 1 см).

А.1.3.5.15 Сахароза, .

А.1.3.5.16 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А. 1.3.5.17 Ацетат натрия, .

А.1.3.5.18 Раствор цитрата натрия, , 400 .

А.1.3.5.19 Раствор гидроксида натрия, NaOH, 0,4

Растворяют в стерильной воде. Автоклавирование не допускается. Перед использованием готовят свежий раствор.

А.1.3.5.20 Раствор хлорида натрия/цитрата натрия (SSC 5, концентрированный 5-кратный основной раствор), (NaCI), 0,75 , (), 0,075 .

Целесообразно готовить концентрированный основной раствор SSC 20 (например, 20-кратный основной раствор, так как растворы с высокой концентрацией солей обычно более устойчивы). Разбавляют перед использованием.

А.1.3.5.21 Уравновешенный фенол

Используется фенол со значением 8,0 ед. рН и уравновешенный буфером Трис/HCI (> 7,8 ед. рН) или, например, приготовленный в соответствии с [5] или рекомендациями изготовителя.

А.1.3.5.22 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.3.5.10) и одну объемную часть изоамилового спирта (А.1.3.5.8).

А.1.3.5.23 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 25 объемных частей насыщенного фенола (А.1.3.5.21) с 24 объемными частями хлороформа (А.1.3.5.10) и одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.3.5.8).

А.1.3.5.24 Раствор мутанолизина в стерильной воде, содержащий 500 или 5000 мутанолизина

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.1.3.5.25 Раствор лизоцима в стерильной воде, содержащий 10 лизоцима

Автоклавирование не допускается. Следует хранить при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания

А.1.3.5.26 Раствор сахарозы, , 400 .

А.1.3.5.27 Буферный раствор А, (Трис), 0,020 , (ЭДТА), 0,020 (NaCI), 0,100

Доводят значение до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.1.3.5.28 Буфер для экстрагирования/лизиса, содержащий 1 объемную часть буферного раствора А (А.1.3.5.27) и одну объемную часть раствора сахарозы (А.1.3.5.26).

А.1.3.5.29 Раствор SDS, (SDS), 250 .

А.1.3.5.30 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, 20

А.1.3.5.31 Раствор этилового спирта, (), 70%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.3.5.32 Раствор ацетата натрия, (), 3

Доводят значение рН до 5,2 ед. рН ледяной уксусной кислотой.

А.1.3.5.33 Буфер ТЕ, (Трис), 0,010 , (ЭДТА), 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.3.6 Оборудование

Применяется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.1.3.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 12000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.3.6.2 Водяная баня или инкубатор.

А.1.3.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.1.3.6.4 Смеситель, например, .

А.1.3.7 Методика

А.1.3.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.1.3.7.2 Методика экстракции ДНК

Йогурт хорошо встряхивают или перемешивают. Переносят 250 йогурта в пробирку вместимостью 2 . Добавляют 80 раствора цитрата натрия (А.1.3.5.18). Добавляют 150 раствора NaOH (А.1.3.5.19) и хорошо перемешивают. Центрифугируют при ускорении 12000g в течение 2 мин.

Осадок после центрифугирования должен иметь диаметр не более 0,7 см и занимать объем не более 100 . В противном случае указанные стадии (добавление 80 раствора цитрата натрия и 150 раствора NaOH) необходимо повторить.

Отбрасывают верхний слой жира и образовавшийся верхний водный слой и осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 раствора SSC 5 (А.1.3.5.20). Центрифугируют не менее 2 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Повторно суспендируют осадок после центрифугирования в 500 раствора SSC 5. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования повторно суспендируют в 500 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.3.5.28). Добавляют 50 раствора лизоцима (А.1.3.5.25). Инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч. Если результаты неудовлетворительные, к раствору лизоцима может быть добавлено 10 ед. мутанолизина (А.1.3.5.24). Однако перед систематическим применением необходимо проверить воздействие этой добавки для соответствующего продукта.

Добавляют 25 раствора SDS (А.1.3.5.29) и 25 раствора протеиназы-К (А.1.3.5.30). Инкубируют в течение 10 мин при температуре 60°С. Добавляют 500 смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.3.5.23) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку. Добавляют один объем смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.3.5.22) и перемешивают. Центрифугируют в течение 3 мин при ускорении приблизительно 12000g.

Переносят верхнюю фазу в новую пробирку. Добавляют 0,1 объема раствора ацетата натрия (А.1.3.5.32) и один объем изопропанола (А.1.3.5.1). Выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Тщательно промывают осадок после центрифугирования не менее 500 раствора этилового спирта (А.1.3.5.31). Центрифугируют смесь в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Эта стадия является очень важной для удаления осаждающихся солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР).

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.1.3.5.33). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.3.8 Перечень примеров

См. таблицу А.З.

Таблица А.3 - Перечень продуктов, к которым был успешно применен описанный метод

Успешно проанализированный продукт	Содержание, добавки и т.д.	Микроорганизм	Ссылка
Обычный йогурт	0,3% жира, 3,5% жира	Streptococcus thermophilus	[9], [11]
Фруктовые йогурты	1,5% жира, модифицированный крахмал, лесной орех, желатин 1,5% жира, 3,8% белка, аспартам, ацесульфам, ананас 3,5% жира, ароматизатор, желатин, персик, кокосовый орех 10% жира, модифицированный крахмал, лимон, ароматизатор, миндаль, пектин, каротин, рибофлавин	Streptococcus thermophilus	[9]
Обычный йогурт, подвергнутый термообработке	3,5%жира	Streptococcus thermophilus	[12]

А.1.3.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения методики, приведенные в таблице А.4, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах [11].

При проведении этого исследования две лаборатории не выполнили проверку гибридизацией. Для данного исследования мутанолизин не использовался.

Таблица А.4 - Данные по эффективности применения метода

Количество участвующих лабораторий	Количество образцов йогурта на лабораторию	Общее количество образцов	Количество корректно идентифицированных образцов
20	10	200	200 (99 контрольных образцов и 101 образец с ГМО)

А.1.4 Метод на основе фенола/хлороформа. Процедура для дрожжей и/или гифомицетов, собранных с пищевых продуктов

А.1.4.1 Общие положения

Данный метод описывает одноступенчатое выделение и очистку ДНК, пригодной для ПЦР, из дрожжей, гифомицетов [13] или выделенных микробных популяций. Метод применим для выделения ДНК из генетически модифицированных микроорганизмов в продуктах очень сложного состава [14], [15]. Метод может использоваться для выделения общей ДНК из продукта [14], [15] или из микробной фракции, которая непосредственно выделена из продукта либо собрана из заквасочных культур (колонии на жидких или агаровых средах).

Примечание - Предварительное выделение микробной фракции из образца для анализа дает наиболее достоверные результаты при выделении ДНК.

Общую ДНК из продукта выделяют с помощью альтернативных методов, приведенных в приложении А. Однако эти методы не гарантируют, что достаточное количество ДНК будет выделено из всех микроорганизмов (особенно из грибов, устойчивых к лизису, или грамотрицательных бактерий). Данный метод может использоваться для выделения общей ДНК из таких продуктов, как йогурт, молоко или сыр. Однако достоверное хорошее выделение ДНК обеспечивается только для тонкоизмельченных или размолотых твердых продуктов. В силу этого перед применением метода его эффективность необходимо всегда проверять на ДНК основного исследуемого продукта.

А.1.4.2 Статус валидации

Этот метод выделения ДНК был применен и проверен [13] на представителях 25 родов грибов, представляющих 325 видов (включая дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве или виноделии, и Penicillia spp. [16], используемые производителями голубого сыра), в форме мицелия и спор (среди которых виды, наиболее устойчивые к лизису, например Aspergillus fumigatus и Cryptococcus neoformans). Данный метод был разработан таким образом, чтобы избежать лабораторного загрязнения и загрязнения между пробами. Такое свойство метода позволяет применять его для проведения систематического выделения ДНК и в больших объемах и применения ее для ПЦР При применении метода не было обнаружено изменений качества матрицы ДНК при качественной ПЦР после долгосрочного хранения при температуре минус 20°С в течение по крайней мере пяти лет или вариаций между различными препаратами ДНК из одного и того же организма. Несмотря на то, что качество выделенной данным методом ДНК подходит для качественной ПЦР, она может подвергаться недостаточному расщеплению в процессе рестрикционного анализа. Однако для использования ДНК, полученной данным методом, для количественной ПЦР необходимо выполнить процедуру ее дополнительной очистки с применением другого метода, например такого, который описан в А.4.

А.1.4.3 Принцип метода

Как правило, бактерии, дрожжи или мицелий разрушаются при перемешивании с высокой скоростью в присутствии стеклянных шариков в смеси Трис - фенол - хлороформ - ЭДТА - SDS, а затем ДНК осаждается этиловым спиртом.

А.1.4.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.1.4.5 Реактивы

А.1.4.5.1 Этиловый спирт, , 96%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.4.5.2 Ледяная уксусная кислота, .

А.1.4.5.3 Серная кислота, , > 90%.

А.1.4.5.4 Бикарбонат калия, .

А.1.4.5.5 Ацетат калия, .

А.1.4.5.6 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.1.4.5.7 Изоамиловый спирт [].

А.1.4.5.8 Фенол, .

А.1.4.5.9 Хлороформ, .

А.1.4.5.10 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.1.4.5.11 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.1.4.5.12 Гидроксид калия, КОН.

А.1.4.5.13 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.1.4.5.14 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.

А.1.4.5.15 Уравновешенный фенол, > 7,8 ед. рН

Используют фенол (А.1.4.5.8), приготовленный в соответствии с [5] или (по выбору) полностью уравновешенный буфером для экстрагирования (А.1.4.5.18) без SDS или в соответствии с рекомендациями изготовителя.

А.1.4.5.16 Смесь хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают 24 объемные части хлороформа (А.1.4.5.9) с одной объемной частью изоамилового спирта (А.1.4.5.7).

А.1.4.5.17 Смесь фенол - хлороформ - изоамиловый спирт

Смешивают одну объемную часть насыщенного фенола (А.1.4.5.15) с одной объемной частью смеси хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.4.5.16).

А.1.4.5.18 Буфер для экстрагирования/лизиса, (Трис) = 0,050 , (ЭДТА) = 0,050 , (SDS) = 30

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.1.4.5.19 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 , (ЭДТА) = 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.1.4.5.20 Раствор рибонуклеазы-А, = 10 лиофилизата.

Следует хранить при температуре минус 20°С.

А.1.4.5.21 Раствор этилового спирта, , 70%-ный

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.1.4.5.22 Раствор ацетата калия, () = 3

Доводят значение рН до 5,2 ед. рН ледяной уксусной кислотой. Автоклавирование не допускается. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А.1.4.5.23 Кондиционированные стеклянные шарики

Стеклянные шарики диаметром 0,2 - 0,5 мм выдерживают в течение ночи в концентрированной серной кислоте (А.1.4.5.3). Промывают их стерильной водой, кипятят в растворе (А.1.4.5.24), снова промывают стерильной водой и высушивают при температуре 80°С в вакууме [13], [14].

А.1.4.5.24 Раствор бикарбоната калия, () = 50

Используют свежеприготовленный водный раствор.

А.1.4.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.1.4.6.1 Встряхиватель для полиэтиленовых микропробирок вместимостью 2 с навинчивающимися колпачками. Скорость встряхивания - не менее 100 встряхиваний/мин (например, Mini-*(3)).

А.1.4.6.2 Микропробирки, полиэтиленовые пробирки вместимостью 2 с кольцевым уплотнением и навинчивающимися колпачками.

А.1.4.6.3 Устройство для фильтрования, фильтры из стекловолокна диаметром 25 мм.

А.1.4.6.4 Центрифуга с ускорением как минимум 10000 g, с ротором, способным удерживать микропробирки вместимостью 2 .

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.1.4.6.5 Водяная баня или инкубатор.

А.1.4.6.6 Вакуумная сушилка (при необходимости). Рекомендуется для приготовления стеклянных шариков (А.1.4.5.23).

А.1.4.6.7 Смеситель, например, .

А.1.4.7 Методика

А.1.4.7.1 Приготовление анализируемой пробы и микробной фракции

Методы выделения микробных фракций, использующие этап обогащения, могут быть приведены в нормативных правовых актах по микробиологическому контролю пищевой продукции. Микробная фракция, полученная после этапа обогащения, может быть использована для выделения ДНК.

Исходя из анализируемой пробы объемом 1 - 2 выделяют микробиологическую популяцию соответствующим образом (см. А.1.3). В качестве альтернативы дрожжи или гифомицеты, выделенные из навески образца, могут культивироваться как заквасочные культуры. В обоих случаях микроорганизмы собираются и подвергаются дальнейшей обработке в соответствии с А.1.4.7.2 или хранятся при температуре минус 20°С до начала обработки.

А.1.4.7.2 Выделение ДНК

А.1.4.7.2.1 Мицелий, собранный на фильтре из стекловолокна, дважды промывают буфером для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18), не содержащим SDS. Мицелиальную пленку снимают с фильтра и переносят ее в микропробирку вместимостью 2 с навинчивающимся колпачком (А.1.4.6.2), содержащую 600 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18) и 600 смеси фенол - хлороформ - изоамиловый спирт (А.1.4.5.17) и наполовину заполненную кондиционированными стеклянными шариками (А.1.4.5.23). Дальнейшая обработка описана в А.1.4.7.2.3.

А.1.4.7.2.2 С осадками после центрифугирования либо общей микробной популяции, бактерий, мицелия, дрожжей, либо дрожжеподобных микроорганизмов необходимо выполнить следующие процедуры. Клетки промывают один раз 1 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18), не содержащего SDS, центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g в течение 10 мин, повторяют по меньшей мере еще один раз, затем повторно растворяют в 600 буфера для экстрагирования/лизиса (А.1.4.5.18) и переносят в микропробирку, содержащую стеклянные шарики и смесь фенол - хлороформ, как указано в А.1.4.7.2.1.

А.1.4.7.2.3 После стадии А.1.4.7.2.1 или А.1.4.7.2.2 содержимое микропробирки перемешивают на встряхивателе (А.1.4.6.1) со скоростью не менее 100 встряхиваний/мин в течение 1 - 2 мин, затем немедленно инкубируют при температуре 65°С в течение от 30 до 120 мин. Центрифугируют при ускорении от 10000 до 13000 g в течение 10 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку.

В случае применения ДНК для дальнейшей количественной ПЦР необходимо выполнить следующие процедуры. После 30 мин инкубирования содержимое микропробирки центрифугируют при ускорении от 10000g до 13000g в течение 15 мин. Переносят образовавшийся верхний слой в новую микропробирку. Добавляют рибонуклеазу-А (А.1.4.5.20) до конечной массовой концентрации 0,001 и инкубируют еще в течение 30 - 90 мин при температуре 65°С.

Добавляют раствор ацетата калия (А.1.4.5.22) до конечной молярной концентрации 0,3 . Перемешивают, добавляют 1,2 этилового спирта (А.1.4.5.1) и инкубируют в течение ночи при температуре минус 20°С или в течение 1 ч при температуре минус 80°С. ДНК осаждают центрифугированием при ускорении от 10000g до 13000g в течение 15 мин при температуре минус 4°С.

После центрифугирования осадок ДНК осторожно промывают раствором этилового спирта (А.1.4.5.21). Сливают образовавшийся сверху слой на бумагу и высушивают содержимое микропробирки в вакууме. ДНК растворяют в 50 - 100 воды. Допускается длительное (до пяти лет) хранение при температуре минус 20°С. На основании проведенных проверок [13] допускается использование воды вместо буфера ТЕ (А.1.4.5.19). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.1.4.8 Перечень примеров

Количество исследованных видов/штаммов указывается в скобках:

Absidia corymbifera (1), Acremonium spp. (2), Aspergillus spp. (119), Candida spp. (7), Cladosporium spp. (2), Cryptococcus spp. (6), Epidermophyton floccosum (1), Fusarium solani (1), Malbranchea pulchella (1), Geotrichum spp. (2), Microsporum canis (1), Paecilomyces spp. (2), Penicillium spp. (20), Pityrosporum ovale (1), Rhizopus spp. (2), Saccharomyces cerevisiae (1), Schizosaccharomyces pombe (1), Scopu-lariopsis brevicaulis (1), Trichoderma spp. (124), Trichophyton spp. (2), Trichosporon spp. (2), Ulocladium botrytis (1), Verticillium tenerum (1).

A.1.4.9 Эффективность применения метода

Эффективность метода проверялась в отношении грибов [13]. При количественном анализе эффективности выделения было установлено, что использование дробления с помощью стеклянных шариков было наиболее эффективным [18].

А.2 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе поливинилпирролидона(ПВП)

А.2.1 Основной метод на основе ПВП

А.2.1.1 Общие положения

Этот простой, быстрый и дешевый метод [19] пригоден для большой группы продуктов, особенно содержащих большие количества полифенольных соединений.

А.2.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен путем внутрилабораторных исследований и применяется для систематического выделения ДНК во многих лабораториях. Данный метод еще не оценивался путем официальных межлабораторных исследований.

А.2.1.3 Принцип

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия и высокой концентрации ЭДТА) и последующее удаление из водной фазы, содержащей ДНК, загрязняющих примесей, например полифенольных молекул, полисахаридов, метаболитов и растворимых белков, с помощью ПВП в комбинации с ацетатом аммония. Последним этапом является осаждение ДНК этанолом, что концентрирует ДНК и очищает ее от солей (см. [19] - [23]).

А.2.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.2.1.5 Реактивы

А.2.1.5.1 Этиловый спирт, , 96%-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.2.1.5.2 Изопропанол, .

А.2.1.5.3 Поливинилпирролидон (ПВП), молекулярная масса М = 360 кДа; характеристическая вязкость (значение К) = 80 - 100*(4).

А.2.1.5.4 Ледяная уксусная кислота, .

А.2.1.5.5 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.2.1.5.6 Хлорид натрия, NaCI.

А.2.1.5.7 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.2.1.5.8 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.2.1.5.9 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.2.1.5.10 Ацетат аммония, .

А.2.1.5.11 Раствор этилового спирта, , 70%-ный.

Следует хранить и использовать при температуре минус 20°С.

А.2.1.5.12 Буфер для экстрагирования, рН = 8,0 ед., (Трис) = 0,2 , (NaCI) = 0,250 , (ЭДТА) = 0,025 , (SDS) = 50 .

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН , используя HCI или NaOH.

А.2.1.5.13 Раствор ацетата аммония, () = 7,5 .

Растворяют в стерильной воде. При необходимости пропускают через фильтр с размером пор 0,22 мкм.

А.2.1.5.14 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,010 , (ЭДТА) = 0,001 .

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.2.1.6 Оборудование

Необходимо использовать обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.2.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 10000 g.

На некоторых этапах необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.2.1.6.2 Водяная баня или инкубатор.

А.2.1.6.3 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.2.1.6.4 Сублимационная сушилка (при необходимости).

А.2.1.6.5 Смеситель, например .

А.2.1.7 Методика

А.2.1.7.1 Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта (матрицы) необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК. При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.2.1.7.2 Методика выделения ДНК

Взвешивают 0,25 г измельченного или жидкого материала в пробирке. Добавляют 1 буфера для экстрагирования (А.2.1.5.12). Перемешивают суспензию при температуре 65°С в течение 1 ч, охлаждают до комнатной температуры. Последовательно смешивают суспензию с 60 мг порошка ПВП (А.2.1.5.3) и 0,5 объема раствора ацетата аммония (А.2.1.5.13). Инкубируют на льду в течение 30 мин.

Центрифугируют при ускорении 1000g в течение 10 мин и переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку. Смешивают верхний слой с одним объемом изопропанола (А.2.1.5.2) и инкубируют при температуре минус 20°С в течение 30 мин. Центрифугируют при ускорении 10000g и температуре 4°С в течение 10 мин и надосадочную жидкость осторожно отбрасывают.

Промывают осадок ДНК в пробирке после центрифугирования двумя объемами раствора этилового спирта (А.2.1.5.11). Этот этап является важным для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР). Надосадочную жидкость осторожно отбрасывают (в случае рыхлого осадка центрифугируют при ускорении 10000g и температуре 4°С в течение 10 мин). Осадок высушивают и повторно растворяют его в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.2.1.5.14). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.2.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для выделения ДНК*(2) из следующих продуктов: детское печенье*(2), детское молоко*(2), бельгийский паштет, панировка (пшеничная или кукурузная) рыбных палочек, шоколадное пирожное с орехами*(2), консервированная кукуруза, брикетированный зерновой концентрат*(2), сырный крокет, нугат с курицей, курица, печенье, глазированное шоколадом*(2), шоколадная паста *(2), кукурузные хлопья*(2) хрустящие овощи, десертный крем*(2), композиции для вскармливания детей, кукурузное печенье*(2), кукурузная мука, мясо свежее и подвергнутое тепловой обработке (говядина, свинина, курица и индейка), рубленое мясо, мюсли*(2), воздушная кукуруза, сухое молоко, колбаса (реализуемая в ломтиках*(2) и коктейльные сосиски*(2), шницель, побеги сои*(2), суповые шарики, соевый белок в мясных препаратах*(2), соевый лецитин*(2), соевые напитки*(2), соевый крем, соус для спагетти*(2), фигурное печенье, соевый творог, вегетарианский рубленый шницель, вафли с шоколадом*(2), вафли*(2), йогурт*(2).

А.3 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе ЦТАБ

А.3.1 Основной метод на основе ЦТАБ

А.3.1.1 Общие положения

Этот метод применим для экстракции ДНК из растений и из продуктов, полученных из растений, так как он позволяет удалять полисахариды и полифенольные соединения, которые могут оказывать негативное влияние на качество выделяемой ДНК. Метод также пригоден и для некоторых других продуктов (см. А.3.1.8).

А.3.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен путем кольцевого тестирования (см. А.3.1.9).

Этот метод широко используется во многих лабораториях для систематического выделения ДНК.

А.3.1.3 Принцип

Метод включает стадию лизиса (термический лизис в присутствии ЦТАБ) и следующие за ней несколько стадий для удаления загрязняющих примесей, например полисахаридов и белков [24].

Для некоторых продуктов рекомендуется использовать различные ферменты, как указано в А.3.1.7. -амилаза добавляется к буферу для лизиса, чтобы разрушить крахмал в случае продуктов, содержащих амилозу. Для большинства продуктов необходима обработка образцов протеиназой-К для удаления белков. Как правило, рекомендуется обработка рибонуклеазой тех продуктов, для которых соосаждение рибонуклеиновой кислоты может создавать трудности для последующего анализа.

Концентрация солей во время проведения стадий выделения - важный параметр для удаления загрязняющих примесей. В случае понижения концентрации солей ниже 0,5 при комнатной температуре и/или снижения температуры ниже 16°С будет образовываться осадок - ЦТАБ-нуклеиновая кислота. Очистки от денатурированных белков и полисахаридов, образующих комплексные соединения с ЦТАБ, можно добиться повышением концентрации солей (например, путем добавления хлорида натрия), в то время как нуклеиновые кислоты становятся при этом растворимыми. Для дальнейшей очистки нуклеиновых кислот от ЦТАБ и комплексов полисахарид/белок используется хлороформ.

Окончательно нуклеиновые кислоты очищают путем осаждения изопропанолом и промывки этиловым спиртом.

А.3.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.3.1.5 Реактивы

А.3.1.5.1 -амилаза (при необходимости) типа IIа, из видов Bacillus, 1500 - 3000 ед./мг белка.

А.3.1.5.2 Хлороформ, .

А.3.1.5.3 Этиловый спирт, , 96%-ный.

А.3.1.5.4 Эталендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.3.1.5.5 Гексадецилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ), .

А.3.1.5.6 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.3.1.5.7 Изопропанол [].

А.3.1.5.8 Протеиназа-К(при необходимости), приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.3.1.5.9 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная от дезоксирибонуклеазы (при необходимости), приблизительно 50 ед./мг лиофилизата.

А.3.1.5.10 Хлорид натрия, NaCI.

А.3.1.5.11 Гидроксид натрия, NaOH.

А.3.1.5.12 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.3.1.5.13 Раствор -амилазы (при необходимости), (-амилаза) массовой концентрации 10 .

А.3.1.5.14 Буфер ЦТАБ для экстрагирования, (ЦТАБ) = 20 , (NaCI) = 1,4 , (Трис) = 0,1 , (ЭДТА) = 0,02 .

Доводят значение рН до 8,0 ед, рН, используя HCI или NaOH.

А.3.1.5.15 Буфер ЦТАБ для осаждения, (ЦТАБ) = 5 , (NaCI) = 0,04 .

А.3.1.5.16 Раствор хлорида натрия, (NaCI) молярной концентрации 1,2 .

А.3.1.5.17 Раствор этилового спирта, , 70%-ный.

А.3.1.5.18 Раствор протеиназы-К в стерильной воде (при необходимости), концентрации 20 .

А.3.1.5.19 Раствор рибонуклеазы-А (при необходимости), массовой концентрации 10 .

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20°С.

А.3.1.5.20 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,01 , с (ЭДТА) = 0,001 .

Доводят значение рН до 8,0 ед, рН, используя HCI или NaOH.

А.3.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.3.1.6.1 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).

А.3.1.6.2 Центрифуга, например микроцентрифуга, обеспечивающая ускорение 12000g.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.3.1.6.3 Смеситель, например .

А.3.1.6.4 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.3.1.7 Методика

А.3.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления навески образца из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера навески анализируемой пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.3.1.7.2 Экстракция ДНК из анализируемой пробы

Взвешивают 200 - 300 мг соответствующим образом приготовленного материала в пробирке.

Добавляют 1,5 предварительно нагретого до 65°С буфера ЦТАБ для экстрагирования (А.3.1.5.14) и перемешивают (в некоторых случаях может потребоваться большее количество буфера для растворения продукта). Добавляют 10 раствора -амилазы (А.3.1.5.13, при необходимости), 10 раствора рибонуклеазы-А (А.3.1.5.19, при необходимости) и осторожно перемешивают. Инкубируют в течение 30 мин при температуре 65°С при перемешивании. Добавляют 10 раствора протеиназы-К (А.3.1.5.18, при необходимости), аккуратно перемешивают содержимое пробирки и инкубируют в течение 30 мин при температуре 65°С при перемешивании (при необходимости). Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку, добавляют от 0,7 до одного объема хлороформа (А.3.1.5.2) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении приблизительно 12000g. Переносят верхнюю (водную) фазу в новую пробирку.

А.3.1.7.3 ЦТАБ-осаждение

Добавляют два объема буфера ЦТАБ для осаждения (А.3.1.5.15). Инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре без перемешивания. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Растворяют осажденную ДНК 350 раствора NaCI (А.3.1.5.16). Добавляют 350 хлороформа (А.3.1.5.2) и тщательно перемешивают. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g. Переносят водную фазу в новую пробирку.

Примечание - ЦТАБ-осаждение является необходимым не для всех продуктов, а только для тех, которые обогащены белками и полисахаридами. При обеспечении получения эквивалентных результатов возможна очистка ДНК альтернативным методом в твердой фазе (например, при использовании вращающихся колонок).

А.3.1.7.4 Осаждение ДНК

Добавляют 0,6 объема изопропанола (А.3.1.5.7), осторожно перемешивают путем переворачивания пробирки и выдерживают ее при комнатной температуре в течение 20 мин. Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Добавляют 500 раствора этилового спирта (А.3.1.5.17) в пробирку и ее содержимое перемешивают, переворачивая несколько раз. Эта стадия является важной для обеспечения полного удаления ЦТАБ. Центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 12000g. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок ДНК в пробирке после центрифугирования высушивают и повторно растворяют его в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.3.1.5.20). Полученный раствор является основным раствором ДНК.

А.3.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для выделения ДНК из следующих продуктов: порошкообразные продукты детского питания, продукты детского питания, смеси для хлебопекарного производства, сухое печенье, бульонные кубики*(2), сладкие и кислые конфеты, консервированная кукуруза, крем-брюле*(2), кормовой жмых, зерно хлебных злаков (рис, пшеница, овес, рожь, гречиха, просо), плиточный шоколад*(2), шоколадный крем*(2), шоколадные конфеты*(2), печенье, глазированное шоколадом*(2), печенье, кукурузное пиво*(2), кукурузные хлопья*(2), десертный крем, декстроза*(2), начинка массы пралине, мелкие мучные кондитерские изделия, рыба*(2), рыбные палочки*(2), хлопья из цельной сои, замороженный картофель, жаренный кусочками, подливка из сока жареного мяса*(2), вареный окорок, мед*(2), кормовая мука быстрого приготовления, кукурузные початки, кукурузная мука, зародыши кукурузы*(2), кукурузный глютеновый корм, листья кукурузы, кукурузный нативный крахмал*(2), кукурузное масло (нативное)*(2), белки из кукурузы*(2), семена/зерна кукурузы, крупка из кукурузы, маргарин*(2), свежее мясо, сухое молоко, молоко, комбикорм для домашних животных, мюсли*(2), семена золотистой фасоли (маш), листья горчицы, воздушная кукуруза (необработанная), хрустящий картофель, картофельный крахмал (нативный), клубни картофеля, листья рапса, рапсовый жмых, рапсовое масло (нерафинированное/нативное)*(2), семена рапса, необработанный соевый лецитин*(2), кормовая мука, готовая к употреблению, салями (с высоким содержанием жира), соленый сухой завтрак (из зерен кукурузы), колбасы, приправы*(2), модифицированные крахмалы (некоторые типы)*(2), сквашенные сливки с луком*(2), соевая мука, зародыши сои (консервированные, замороженные), соевый белок*(2), соевые напитки*(2), семена/зерна сои, соевый творог, соя (подкисленная)*(2), листья сахарной свеклы, семена сахарной свеклы, семена подсолнечника, рыбный фарш с соей*(2), сахарная кукуруза, оболочка тако (мексиканский пирожок), тарамас (паста из икры рыб), табак, томатный кетчуп*(2), томатный концентрат*(2), томаты (плоды), кукурузные чипсы*(2), вегетарианский рубленый шницель, вафли *(2), пшеничный крахмал (нативный), йогурт*(2).

А.3.1.9 Эффективность применения метода

Данные по эффективности применения метода, приведенные в таблице А.5, были получены в результате совместного исследования, выполненного рабочей группой "Разработка методов идентификации пищевых продуктов, полученных с использованием способов генной инженерии" Комиссии Федерального управления по охране здоровья Германии для внедрения методов согласно статье 35 закона Германии о пищевых продуктах (см. [25] - [27]). В качестве испытуемых матриц использовались картофель, соя и томаты.

При проведении межлабораторных испытаний масса образца составляла 100 мг. Стадия ЦТАБ-осаждения была необходима для анализа сои и соевой муки. Стадии с использованием ферментов в этих межлабораторных испытаниях не проводились.

При проведении совместных исследований сои две из участвующих лабораторий использовали сильно измененные методики, а в одной лаборатории испытание пяти образцов было прервано. Таким образом, 22 из 25 участников правильно идентифицировали все 110 проб.

При проведении межлабораторных испытаний картофеля три образца дали ложноотрицательные результаты, а один образец дал ложноположительный результат. Три образца не были оценены из-за получения неоднозначных результатов двух повторных анализов.

Таблица А.5 - Данные эффективности применения метода

Продукт	Количество участвующих лабораторий	Количество образцов на лабораторию	Общее количество образцов	Количество корректно идентифицированных образцов
Соя [25]	25	5	125	110
Картофель [26]	18	10	180	173
Томаты [27]	18	5	90	90

А.4 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе диоксида кремния

А.4.1 Основной метод на основе диоксида кремния

А.4.1.1 Общие положения

Настоящий метод пригоден для экстракции ДНК из большой группы продуктов (см. примеры в А.4.1.8). Этот метод также может применяться как метод дополнительной очистки растворов ДНК, полученных после выделения ДНК другими методами.

Метод адаптирован к опубликованной процедуре [28]. В случае пригодности метода к ДНК какого-либо продукта он имеет определенные преимущества, состоящие в том, что позволяет избегать использования очень токсичных реактивов. Кроме того, по причине отсутствия неустойчивых поверхностей раздела фаз (например, вода - хлороформ) и необходимости центрифугирования с низкой скоростью метод может быть легко адаптирован для выполнения ручных анализов высокой производительности и их автоматизации.

Настоящий метод не рекомендуется для выделения ДНК из продуктов с высоким содержанием жира.

А.4.1.2 Статус валидации

Этот метод прошел внутрилабораторную проверку и используется для систематических анализов во многих лабораториях. Метод не подвергался оценке путем официальных межлабораторных исследований. Принцип этого метода положен в основу множества созданных наборов и тест-систем для экстракции ДНК (см. [29] - [31]).

А.4.1.3 Принцип

Метод состоит из стадии лизиса (термический лизис в присутствии додецилсульфата натрия в буферном растворе) и последующей стадии очистки с помощью смол из диоксида кремния в присутствии разобщающего агента, вызывающего диссоциацию комплексов, гуанидина гидрохлорида. Принцип метода состоит в связывании нуклеиновых кислот диоксидом кремния при низкой водной активности в результате энтропийного эффекта [32]. Загрязняющие примеси вымывают из смолы изопропанолом, в то время как ДНК остается прикрепленной к адсорбенту. Во время заключительной стадии элюирования буферным раствором с низким содержанием соли извлекается ДНК.

А.4.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.4.1.5 Реактивы

А.4.1.5.1 Хлорид натрия, NaCI.

А.4.1.5.2 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.4.1.5.3 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.4.1.5.4 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.4.1.5.5 Гидроксид натрия, NaOH.

А.4.1.5.6 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.4.1.5.7 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.4.1.5.8 Гуанидин гидрохлорид, .

А.4.1.5.9 Хлорид калия, KCI.

А.4.1.5.10 Гидроортофосфат натрия, .

А.4.1.5.11 Дигидроортофосфат калия, .

А.4.1.5.12 Изопропанол [].

А.4.1.5.13 Диоксид кремния (), диоксид кремния с гранулометрическим составом от 0,5 до 10 мкм (80% частиц от 1 до 5 мкм)*(5).

А.4.1.5.14 Рибонуклеаза-А, свободная от дезоксирибонуклеазы, приблизительно 100 ед./мг лиофилизата.

А.4.1.5.15 Раствор протеиназы-К, концентрацией 20

Растворяют фермент в стерильной воде или буфере, как описано в [34]. Автоклавирование раствора не допускается. Хранить в виде аликвот при температуре минус 20°С, избегать многократного замораживания и оттаивания.

А.4.1.5.16 Раствор I гуанидина гидрохлорида, () = 5

Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121°С.

А.4.1.5.17 Раствор II гуанидина гидрохлорида, () = 6 .

Автоклавируют не более 15 мин при температуре 121°С.

А.4.1.5.18 Буферный раствор PBS, (NaCI) = 0,157 , (KCI) = 0,0027 , () = 0,010 , () = 0,0018

Доводят значение рН до 7,5 ед. рН, используя HCI.

А.4.1.5.19 Суспензия диоксида кремния

Взвешивают 5 г диоксида кремния (А.4.1.5.13) в пробирке вместимостью 50 и добавляют 50 буфера PBS (А.4.1.5.18). Хорошо перемешивают и оставляют для осаждения на 2 ч. Надосадочную жидкость удаляют путем отсасывания с помощью пипетки. Добавляют еще 50 буфера PBS, хорошо перемешивают и оставляют для осаждения на 2 ч. Образовавшуюся надосадочную жидкость удаляют. Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении 2000 g. Надосадочную жидкость отбрасывают. После центрифугирования повторно растворяют осадок в пробирке 50 раствора II гуанидина гидрохлорида (А.4.1.5.17). Используют в течение 2 - 5 мес. Хорошо перемешивают перед использованием.

А.4.1.5.20 Буфер для экстрагирования TNE-SDS, (NaCI) = 0,150 , (Трис) = 0,002 , (ЭДТА) = 0,002 , (SDS) = 10 .

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH, и автоклавируют перед добавлением SDS.

А.4.1.5.21 Раствор изопропанола [], 80%-ный.

А.4.1.5.22 Буферный раствор ТЕ, (Трис) = 0,010 , (ЭДТА) = 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.4.1.5.23 Раствор рибонуклеазы-А массовой концентрации 10

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20°С, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.4.1.6 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

А.4.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение не менее 2000g.

На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.4.1.6.2 Инкубатор с рабочей температурой 60°С.

А.4.1.6.3 Встряхиватель, который должен помещаться внутри инкубатора (шейкер-инкубатор).

А.4.1.6.4 Смеситель, например, .

А.4.1.6.5 Пробирки для центрифугирования вместимостью 50 для приготовления суспензии диоксида кремния.

А.4.1.7 Методика

А.4.1.7.1 Общие положения

Сразу после приготовления анализируемой пробы из исследуемого продукта необходимо выполнить описанную ниже процедуру выделения и очистки ДНК.

При изменении размера навески пробы требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.4.1.7.2 Методика выделения ДНК

Взвешивают 200 - 300 мг размолотого или измельченного материала в пробирке. Добавляют 2 буфера для экстрагирования (А.4.1.5.20) и 20 раствора протеиназы-К (А.4.1.5.15). Инкубируют в течение 1 - 5 ч при температуре 60°С. Во время инкубирования образцы необходимо интенсивно встряхивать (приблизительно 250 встряхиваний в мин). Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 2000g. Переносят 550 образовавшегося верхнего слоя в новую пробирку.

Надосадочную жидкость обрабатывают 2 раствора рибонуклеазы (А.4.1.5.23) в течение 5 мин при температуре 37°С (стадию гидролиза РНК рекомендуется проводить перед стадией связывания диоксидом кремния, в противном случае гидролизованная РНК и полученные в результате нуклеотиды могут оказывать влияние на последующие измерения на ультрафиолетовом спектрометре). Добавляют 55 раствора I гуанидина гидрохлорида (А.4.1.5.16) и 100 суспензии диоксида кремния (А.4.1.5.19). Осторожно перемешивают несколько раз. Пробирки оставляют на лабораторном столе приблизительно на 1 мин.

Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 800g. Надосадочную жидкость отбрасывают и добавляют 500 раствора изопропанола (А.4.1.21). Пробирки закрывают и перемешивают, желательно с помощью смесителя (А.4.1.6.4), для повторного полного растворения осадка после центрифугирования.

Центрифугируют в течение 2 мин при ускорении приблизительно 1500g. Надосадочную жидкость отбрасывают и осадок после центрифугирования высушивают. Добавляют 100 буферного раствора ТЕ (А.4.1.5.22). Осторожно перемешивают для повторного растворения осадка после центрифугирования. Инкубируют при температуре 60°С в течение 5 мин. Центрифугируют в течение 5 мин при ускорении 2000g. Переносят 80% образовавшегося верхнего слоя в новую пробирку. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не перенести частицы диоксида кремния, которые оказывают ингибирующее воздействие на ферменты (например, ДНК-полимеразы, эндонуклеазы).

Перенесенный слой обрабатывают 2 раствора рибонуклеазы (А.4.1.5.23) в течение 1 ч при температуре 37°С или в течение всей ночи при комнатной температуре. Этот раствор является основным раствором ДНК.

А.4.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для экстрагирования ДНК*(2) из следующих продуктов: зародыши кукурузы*(2), кукурузная мука, кукурузный глютеновый корм*(2), листья кукурузы, модифицированный кукурузный крахмал*(2), нативный кукурузный крахмал*(2), семена кукурузы, кукурузная крупка, белок из сои*(2), соя, листья сои, сахарная свекла (свежие корнеплоды), сахарная свекла (замороженный жом), листья сахарной свеклы.

А.5 Получение ДНК, применимой для ПЦР, методами экстракции ДНК на основе гуанидина-хлороформа

А.5.1 Основной метод на основе гуанидина-хлороформа

А.5.1.1 Общие положения

Данный метод пригоден для экстрагирования ДНК из большой группы пищевых продуктов и кормов (см. А.5.1.8). В зависимости от состава пробы в некоторых случаях может потребоваться стадия дополнительной очистки.

А.5.1.2 Статус валидации

Этот метод был проверен с применением процедуры внутрилабораторной проверки.

А.5.1.3 Принцип

Метод заключается в термическом и ферментативном лизисе в присутствии додецилсульфата натрия в денатурирующем буферном растворе гуанидина. В некоторых случаях в зависимости от продукта необходим дополнительный этап очистки.

Загрязняющие примеси, например липиды и белки, удаляются на стадии экстрагирования хлороформом после лизиса. Следующим этапом является осаждение ДНК изопропанолом.

А.5.1.4 Меры безопасности

Работы с органическими реактивами следует выполнять в вытяжном шкафу.

А.5.1.5 Реактивы

А.5.1.5.1 -амилаза типа IIа, из видов Bacillus, 1500 - 5000 ед./мг лиофилизата.

А.5.1.5.2 Ледяная уксусная кислота, .

А.5.1.5.3 Хлороформ, .

А.5.1.5.4 Этиловый спирт (), 96%-ный.

А.5.1.5.5 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА), .

А.5.1.5.6 Гуанидин гидрохлорид, .

А.5.1.5.7 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.5.1.5.8 Изопропанол [].

А.5.1.5.9 Протеиназа-К, приблизительно 20 ед./мг лиофилизата.

А.5.1.5.10 Рибонуклеаза-А, выделенная из бычьей поджелудочной железы, свободная отдезокси-рибонуклеазы, приблизительно 50000 ед./мг лиофилизата.

А.5.1.5.11 Хлорид натрия, NaCI.

А.5.1.5.12 Додецилсульфат натрия (SDS), .

А.5.1.5.13 Гидроксид натрия, NaOH.

А.5.1.5.14 Трис(оксиметил) аминометан (Трис), .

А.5.1.5.15 Раствор -амилазы в стерильной воде, концентрацией 10

А.5.1.5.16 Раствор этилового спирта, , 70%-ный.

А.5.1.5.17 Буфер для экстрагирования, (Трис) = 0,1 , (NaCI) = 0,15 , (ЭДТА) = 0,05 , (SDS) = 10

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.5.1.5.18 Раствор гуанидина гидрохлорида () молярной концентрации 5

После приготовления раствор автоклавируют(не более 15 мин при температуре 121°С).

А.5.1.5.19 Раствор протеиназы-К в стерильной воде, массовой концентрации 20

А.5.1.5.20 Раствор рибонуклеазы-А массовой концентрации 10

Следует хранить в виде аликвот при температуре минус 20°С.

А.5.1.5.21 Буфер ТЕ, (Трис) = 0,01 , (ЭДТА) = 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH.

А.5.1.6 Оборудование

А.5.1.6.1 Центрифуга, обеспечивающая ускорение 8000g. На некоторых стадиях анализа необходимо использовать центрифугу с охлаждением.

А.5.1.6.2 Инкубатор, желательно с устройством для встряхивания (шейкер-инкубатор).

А.5.1.6.3 Смеситель, например, .

А.5.1.7 Методика

А.5.1.7.1 Общие положения

При изменении размера навески образца требуется соответственно масштабировать массы реактивов и объемы буферов.

А.5.1.7.2 Методика экстракции ДНК

Взвешивают 200 - 500 мг измельченного материала в микропробирке. Добавляют 1,6 предварительно нагретого до температуры 60°С буфера для экстрагирования (А.5.1.5.17).

Добавляют 10 раствора рибонуклеазы-А (А.5.1.5.20) и 10 раствора -амилазы (А.5.1.5.15) и осторожно перемешивают, переворачивая пробирку вручную. Инкубировать в течение 50 мин при температуре 60°С при умеренном перемешивании. Добавляют 1/10 объема раствора гуанидина гидрохлорида (А.5.1.5.18), тщательно перемешивают с помощью смесителя (А.5.1.6.3).

Добавляют 20 раствора протеиназы-К (А.5.1.5.19), плавно перемешивают, переворачивая пробирку вручную, и инкубируют не менее 2 ч при температуре 60°С при умеренном перемешивании. Пробирки оставляют на лабораторном столе на 15 мин, затем центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 8000g.

Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку. Добавляют один объем хлороформа (А.5.1.5.3) и перемешивают с помощью смесителя (А.5.1.6.3). Центрифугируют в течение 15 мин при ускорении 8000g. Переносят надосадочную жидкость в новую пробирку. Добавляют 0,6 объема изопропанола (А.5.1.5.8), перемешивают путем переворачивания. Пробирки оставляют на льду на 50 мин.

Центрифугируют в течение 20 мин при ускорении 8000g. Осадок после центрифугирования промывают не менее чем 2 раствора этилового спирта (А.5.1.5.16) и центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 8000g. Эта стадия является важной для удаления любых солей, которые могут оказывать влияние на последующий анализ (например, ПЦР). Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после центрифугирования высушивают и повторно растворяют в 100 воды или соответствующего буфера, например буфера ТЕ (А.5.1.5.21). Этот раствор является основным раствором ДНК. Если потребуется дополнительная стадия очистки, то ее необходимо выполнять на основном растворе ДНК.

А.5.1.8 Перечень примеров

Метод был успешно применен для экстрагирования ДНК*(2) из следующих продуктов: подкисленная соя, консервированная кукуруза, кормовой жмых, плиточный шоколад*(2), десертный крем*(2), хлопья из цельной сои, початки кукурузы, кукурузная мука, зародыши кукурузы*(2), кукурузный глютеновый корм*(2), модифицированный кукурузный крахмал*(2), белки из кукурузы*(2), семена/зерна кукурузы, кукурузная крупка, нативный кукурузный крахмал*(2), семена/зерна рапса, соусы*(2), мука из сои, соевый творог, соевый лецитин (необработанный коричневый*(2) и рафинированный желтый*(2), белок из сои, семена/зерна сои, кукурузные чипсы*(2).

Данный метод непригоден для анализа проб масел, мальтодекстрина, D-глюкозы, мальтита, маннита или ксилита массой 1 г.

А.5.2 Гуанидин хлороформный метод: Протокол для соевого лецитина

А.5.2.1 Назначение, обоснованность, научное основание

Соевый лецитин часто используется во многих продуктах питания в качестве эмульгатора. Лецитин может производиться из сои как генетически модифицированной (ГМ), так и генетически неизмененной. Описанный метод можно использовать для экстракции ДНК из исследуемого образца, чтобы в последующем провести ПЦР для обнаружения генетически модифицированных последовательностей ДНК из ГМ-сои. Метод взят из [44], подобная методика была апробирована в ходе межлабораторного исследования в Швейцарии. В данном исследовании количество выделенной ДНК определялось спектрометрическим способом [35]. Дополнительную экспертизу проводил Химический и Ветеринарный институт Фрайбурга (Германия) совместно с 12 лабораториями, в ходе которой количество выделенной и в последующем амплифицированной ДНК сои было определено посредством количественного ПЦР-анализа в реальном времени. Результаты опубликованы в источнике [45].

А.5.2.2 Область применения

Настоящий метод описывает процедуру экстракции ДНК из соевого лецитина в сыром растительном масле, полученном способом холодного прессования. Если содержание ДНК в исследуемом материале низкое, для определения количества ДНК, выделенной из анализируемой пробы, и для вычисления практического предела обнаружения, доступного при использовании ПЦР-анализа, используется ПЦР в реальном времени.

А.5.2.3 Статус валидации и критерии исполнения

А.5.2.3.1 Статус валидации

Метод, описанный в этом подпункте, был апробирован в ходе межлабораторного исследования по определению количества выделяемой и амплифицируемой ДНК сои с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Совместное исследование было выполнено в соответствии с протоколом IUPAC [46].

А.5.2.3.2 Надежность метода

Методика обычно использовалась для тестирования ГМО в испытательных и частных лабораториях в Германии и Швейцарии, на протяжении более 10 лет и ни о каких проблемах не сообщалось. Хотя специфические данные надежности (например, по модификации параметров метода) и недоступны, опыт различных лабораторий показал, что небольшая вариация условий используемой методики не сказывается на ее эффективности.

А.5.2.3.3 Внутрилабораторные испытания

Материалы, использовавшиеся в совместном межлабораторном исследовании, для оценки относительной точности метода были проверены в лаборатории, которая разработала данный метод. Для оценки точности были подготовлены пять экстракций ДНК из каждого из пяти лецитинов сои, проведены измерения с помощью ПЦР в реальном времени при воспроизводимых условиях с использованием метода, специфичного для гена лектина сои согласно ИСО 21570:2005, С.2 [41]. Результаты приведены в таблице А.6.

Таблица А.6 - Внутрилабораторная проверка достоверности метода выделения ДНК с пятью образцами соевого лецитина (n = 5 повторностей экстракций)

Образец лецитина, N	Среднее количество копий гена лектина	Стандартное отклонение повторяемости , количество копий	Стабильность коэффициента вариации , %
1	20464	5367	26
2	3203	620	19
3	2005	306	15
4	6978	331	5
5	14	8	61

Предварительно, до проведения межлабораторной проверки, ДНК была выделена из пяти коммерческих лецитинов сои и проверена на возможность ингибирования ПЦР. Подготовленная ДНК от каждого образца была растворена в буфере ТЕ (один объем ДНК растворяли в четырех объемах ТЕ буфера; один объем ДНК первого разбавления растворяли в четырех объемах ТЕ; один объем ДНК второго разбавления растворяли в четырех объемах ТЕ). Различие между (предполагаемым) расчетным -значением неразбавленного образца ДНК, и измеренным -значением каждого разбавления ДНК, были ниже 0,1, из чего следует, что ДНК свободна от ПЦР-ингибиторов.

А.5.2.3.4 Совместные межлабораторные испытания

Совместное испытание (исследование достоверности) было выполнено в 12 лабораториях [45]. Для оценки использовали пять коммерчески используемых образцов лецитинов сои. Каждая лаборатория получила 15 закодированных образцов и стандартную ДНК для калибровки. Образцы были распределены таким образом, чтобы каждый участник получил три идентичных образца каждого из пяти лецитинов сои. Для каждой лаборатории было выполнено единственное выделение ДНК из образца. Возвращенные результаты были разделены на пять различных образцов лецитина для оценки результатов совместного испытания.

Выделенные ДНК были протестированы методом ПЦР в реальном времени при амплификации последовательности ДНК геналектина сои согласно методике ИСО 21570:2005, С.2 [41]. ДНК-стандарт для калибровки был приготовлен из соевой муки [ERM BF410a*(6)] при помощи Plant Mini Kit*(7) (Qiagen, Hilden/Germany); в начале выделение ДНК производилось с применением ЦТАБ. Концентрацию ДНК оценивали флюориметрически с использованием методики PicoGreen*(7) dsDNA [17]. Стандарты ДНК были определены как число копий (ЧК) эквивалентов гаплоидного генома в . Для удобства вычисления масса гаплоидного генома сои была принята равной 1,13 пг. Был подготовлен ряд разведений в пределах 50 000 (ЧК)/5 до 80 (ЧК)/5 . Семь лабораторий использовали оборудование ПЦР в реальном времени производства ABI*(7) (ABI 7000, 7500, 7700), пять лаборатории использовали приборы Light Cycler*(7) (Roche) со следующими модификациями к протоколу, описанному в ИСО 21570:2005 [41]: конечный объем для ПЦР составил 20 , QuantiTect Probe PCR Master Mix*(7) (Qiagen) с праймерами GM1-F и GM1-R в концентрации 500 каждый и 150 образца GM1. Программа ПЦР в реальном времени состояла из следующих этапов: горячий старт - 900 с 95°С, 45 циклов; денатурация ДНК - 10 с при 95°С; отжиг праймеров - 30 с при 60°С и элонгация - 30 с при 72°С. Флуоресцентный сигнал включался в цепь ДНК на этапе элонгации. Температура хранения - 2°С.

Критерий пригодности метода, а также практический предел обнаружения, , для генетически модифицированной сои был определен в соответствии с ИСО 24276. Значения (в процентах) были вычислены индивидуально для каждого образца по формуле

(A.1)

где - предел детектирования специфического для события метода ПЦР в реальном времени, использовавшегося для количественной оценки, число копий за ПЦР;

- количество амплифицируемой ДНК сои в пробе, в копиях за ПЦР, определенное посредством метода ПЦР в реальном времени, специфического для референсного гена сои.

Примечание - Для вычисления в таблице А.7 LOD принят как 10 копий.

Таблица А.7 суммирует результаты совместного межлабораторного испытания, В четырех из пяти образцов были получены значения ниже 0,9% (пример для существующего законодательного порога). Для образца лецитина 2 был выше 0,9% только в одной лаборатории, для образца лецитина 3 - в двух лабораториях. Для образца лецитина 5 все лаборатории амплифицировали меньше 80 копий геналектина, и таким образом не удалось достичь значения 0,9% или менее. Кроме того, были вычислены коэффициенты вариации воспроизводимости для числа копий лектина, сообщавшиеся для пяти образцов лецитина. Всего для оценки использовали данные ПЦР в реальном времени 36 экстракций ДНК на один образец лецитина сои. При расчете коэффициента вариации воспроизводимости не было удалено ни одного "выброса". Точность данных для образца 5 не могла быть приведена из-за низкого количества копий лектина, которое было ниже LOQ метода. Было отмечено, что данные точности отражают коэффициента вариации воспроизводимости числа копий, экстрагированных из образцов лецитина в условиях воспроизводимости межлабораторных исследований.

Таблица А.7 - Сводка результатов подтверждения правильности данных

Образец лецитина N	Среднее количество копий лектина	Коэффициент вариации воспроизводимости , %	Средний лимит практического обнаружения	Количество лабораторий с < 0,9%
1	17 044	67	0,06	12/12
2	3 630	63	0,28	11/12
3	2 318	57	0,43	10/12
4	8 325	52	0,12	12/12
5	< 80	Не обнаруживается	> 10	0/12

А.5.2.4 Принципы и заключения

Материал из вязкого образца гомогенизируют после нагревания и экстрагируют с помощью гексана после добавления гуанидин тиосульфатного буфера. Мешающие сопутствующие вещества отделяют экстракцией хлороформом, а присутствующую в растворе РНК разрушают РНКазой А. ДНК осаждают изопропанолом в присутствии гликогена, затем промывают этиловым спиртом и растворяют в воде. Для очистки ДНК проводят гель-фильтрацию (с использованием перекрестно-сшитого декстранового геля для разделения по размеру).

А.5.2.5 Термины и определения

Для целей этого подпункта применяются условия и определения, предусмотренные в ИСО 21571 [43] и ИСО 24276.

А.5.2.6 Тип и количество образца

Следует убедиться, что анализируемая проба репрезентативна для исследования лабораторной пробы. Измерения и операционные этапы, которые следует выполнить, описаны в 5.1. Материал образца должен быть максимально гомогенным.

А.5.2.7 Оценка отклонения измерений

Отклонения в данных ПЦР в реальном времени для гена лектина, определенные в ходе межлабораторных испытаний, приведены как коэффициент вариации воспроизводимости. Результаты приведены в таблице А.7.

А.5.2.8 Мешающие факторы

Степень рафинирования лецитина может влиять на способность экстракции ДНК из образцов лецитина из-за возможной деградации ДНК, сопровождающей этот технологический процесс.

А.5.2.9 Условия окружающей среды

Никакие особые условия не требуются. См. ИСО 24276.

А.5.2.10 Оборудование

Используется обычное лабораторное оборудование.

А.5.2.10.1 Настольная центрифуга для пробирок на 1,5 или 2 , обеспечивающая ускорение 12000g.

А.5.2.10.2 Центрифуга для пробирок на 50 , обеспечивающая ускорение не менее 4000g.

А.5.2.10.3 Полипропиленовые центрифужные пробирки на 1,5, 2,0 и 50 , для использования в центрифугах на 12000g и 4000g.

А.5.2.10.4 Нагревательный блок со встряхивателем*(8).

А.5.2.10.5 Вакуумная сушилка (при необходимости).

А.5.2.10.6 Мультимиксер, например .

А.5.2.10.7 Термоциклер ПЦР в реальном времени, снабженный источником энергии, необходимым для возбуждения флуоресцентных молекул, а также оптической системой обнаружения, пригодной для обнаружения флюоресценных сигналов, генерируемых в ходе ПЦР.

А.5.2.10.8 Реакционные пробирки с крышками или колпачками, которые могут выдерживать без повреждения неоднократное нагревание до 100°С и охлаждение до 4°С, а также не влияющие на сигнал флюоресценции, генерируемый во время амплификации.

А.5.2.10.9 УФ-спектрофотометр или флюориметр, для определения концентрации ДНК.

А.5.2.11 Реактивы и материалы

Характеристики качества используемых реактивов см. в ИСО 24276.

А.5.2.11.1 Гуанидин тиоцианат.

А.5.2.11.2 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) или Трис(оксиметил) аминометангидрохлорид (Трис-HCI).

А.5.2.11.3 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА).

А.5.2.11.4 Панкреатическая рибонуклеаза А.

А.5.2.11.5 Гликоген.

А.5.2.11.6 Трет-октилфениловый эфир полиэтиленгликоля [4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)фенилполиэтиленгликоль], Triton Х-100*(9).

А.5.2.11.7 н-Гексан.

А.5.2.11.8 Хлороформ.

А.5.2.11.9 Хлорид натрия.

А.5.2.11.10 Натрия гидроксид.

А.5.2.11.11 Соляная кислота, HCI, 37%-ная.

А.5.2.11.12 Раствор гидроксида натрия (NaOH) = 0,1 . 10 г гидроксида натрия вносят в мерную колбу на 250 , заполняют колбу водой до калибровочной метки.

А.5.2.11.13 Изопропанол (2-пропанол).

А.5.2.11.14 Раствор этилового спирта, , 70%-ный. Смешивают 70 этилового спирта с 30 воды.

А.5.2.11.15 Трис-HCI буфер, 6,4 ед. рН, (Трис-HCI) = 0,1 . Растворяют 1,57 г Трис-HCI в приблизительно 70 воды, доводят рН до 6,4 ед. рН соляной кислотой, переливают в мерную колбу на 100 и доводят до объема 100 водой.

А.5.2.11.16 Буфер Трис-HCI + NaCI, 7,5 ед. рН, (Трис-HCI) = 10 , (NaCI) = 15 . Растворяют 0,166 г Трис-HCI и 88 мг хлорида натрия приблизительно в 70 воды, доводят рН до 7,5 ед. рН используя соляную кислоту, переливают в мерную колбу на 100 и доводят до объема 100 водой.

А.5.2.11.17 Раствор ЭДТА, 8,0 ед. рН, молярной концентрации 0,5 . Растворяют 18,6 г двунатриевой соли ЭДТА в приблизительно 70 воды, доводят рН до 8,0 ед. рН используя гидроксид натрия, переливают в мерную колбу на 100 и доводят до объема 100 водой.

А.5.2.11.18 Буферный раствор ТЕ, (Трис) = 0,010 и (ЭДТА) = 0,001 .

А.5.2.11.19 Гуанидин тиоционатный буфер, (Трис-HCI) 4,6 , () 0,02 , (Тритон Х-100) 11,8 . Смешивают 2,6 г Тритона Х-100 (5.2.11.6) и 120 г гуанидин тиоционата (5.2.11.1) и растворяют в 100 Трис-HCI буфере (5.2.11.15), добавляют 8,8 раствора ЭДТА (А.5.2.11.17) и 13,2 воды. Конечный объем буфера - приблизительно 220 при 7,2 ед. рН. Раствор может храниться при комнатной температуре в течение по крайней мере 12 мес.

А.5.2.11.20 Раствор рибонуклеазы-А, (РНКаза А) 10 , в соответствии с инструкцией изготовителя или [3]. Растворяют 10 мг рибонуклеазы-А (5.2.11.4) в 1,0 буфере Трис HCI + NaCI (5.2.11.16). Нагревают раствор в течении 15 мин при 9,5°С, медленно охлаждают при комнатной температуре и затем разделяют на аликвоты по 50 . Следует хранить раствор в замороженном виде, избегая многократного замораживания и оттаивания.

А.5.2.11.21 Раствор гликогена, (гликоген) 20 . Навеску 200 мг гликогена в 15 центрифужной пробирке растворяют в 10 деионизированной воды. Аликвоты раствора можно хранить при 5°С до 24 мес.

А.5.2.11.22 Буфер для элюирования, (0,2 ТЕ), (Трис-HCI) = 2 , (ЭДТА) = 0,2 , 8,0 ед. рН. Растворяют 158 мг Трис-HCI и 37 мг двунатриевой соли ЭДТА приблизительно в 400 воды; Доводят рН до 8,0 ед. рН. Переливают раствор в мерную колбу на 500 и доводят до объема водой. Раствор автоклавируют. Аликвоты раствора можно хранить при комнатной температуре в течение 12 мес.

А.5.2.11.23 Колонка MicroSpin S-300 HR для дополнительной очистки ДНК (Amersham Pharmacia Biotech)*(10)

А.5.2.11.24 Quant-iT PicoGreen dsDNA Quantitation Kit для флюориметрической оценки ДНК (Invitrogen)*(10)

А.5.2.12 Отбор образцов, транспортирование, консервация и хранение

Никаких специальных требований не устанавливается.

А.5.2.13 Приготовление анализируемой пробы

Для экстракции и очистки ДНК используйте протокол, приведенный ниже. Необходима адаптация массы реактивов и объемов буферов к размеру выбранной анализируемой пробы.

Обычно лецитин или растительные масла, которые не подвергались очистке, могут быть взвешены непосредственно. Вязкие образцы лецитина перед взвешиванием необходимо предварительно нагреть до 60°С и хорошо встряхнуть.

А.5.2.14 Калибровка инструментов

Инструменты должны быть прокалиброваны согласно ИСО/МЭК 17025 [39].

А.5.2.15 Этапы метода

А.5.2.15.1 Общая часть

Для экстракции растворителями материал вязкого образца обрабатывают гексаном и гуанидин тиоцианатным буфером. Способные помешать дальнейшему анализу вещества удаляют экстракцией хлороформом, а оставшуюся РНК разрушают РНКазой А. ДНК осаждают в присутствии гликогена изопропанолом, затем промывают раствором этилового спирта и растворяют в воде. Для удаления ингибиторов ПЦР ДНК очищают гель-фильтрацией.

А.5.2.15.2 Процедура экстракции ДНК

Убедившись, что материал образца является максимально гомогенным и помещают 2,5 г в полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 . Процедуру экстракции для "холостого" (контрольного) образца проводят параллельно.

Добавляют 15 н-гексана и растворяют лецитин. Добавляют 2 гуанидин тиоционатного буфера и тщательно смешивают раствор (например, в течение 10 - 20 с, используя миксер). Центрифугируют раствор в течение 10 мин при 4000 g. Большую часть верхней гексановой фазы удаляют. Нижнюю водную фазу (без осадка) перемещают в стерильную 2 полипропиленовую реакционную пробирку. Центрифугируют раствор в течение 10 мин при 10000g. Переносят 1 нижней водной фазы в стерильную 2 полипропиленовую реакционную пробирку. Добавляют 0,5 хлороформа и тщательно перемешивают раствор в течение 2 мин. Центрифугируют раствор в течение 10 мин при 10000g. Переносят от 500 до 750 водного супернатанта в новую 1,5 полипропиленовую реакционную пробирку и добавляют 5 раствора рибонуклеазы-А. (Стадия обработки рибонуклеазой-А, проводившаяся при межлабораторных исследованиях, при отсутствии в ней необходимости может быть пропущена. В этом случае экстракцию можно проводить с этапа добавления гликогена).

Смесь в течение 10 мин выдерживают при комнатной температуре, чтобы гидролизировать любую содержащуюся в материале РНК. Добавляют 4 раствора гликогена и 0,8 объема изопропилового спирта (относительно используемого объема надосадочной жидкости в пробирке), осторожно перемешивают получившийся раствор и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Центрифугируют раствор в течение 10 мин при не менее чем 12000g. Всю надосадочную жидкость из пробирки сливают и осадок ДНК промывают 500 этилового спирта. Центрифугируют раствор в течение 5 мин при не менее чем 12000 g. Спирт тщательно сливают, ДНК высушивают при комнатной температуре или в вакууме. Осадок ДНК растворяют в 50 буфера для элюирования (например, выдерживанием в течение ночи в холодильнике; если не достигнуто полного растворения, слегка нагревают).

А.5.2.15.3 Очистка ДНК посредством гель-фильтрации

Для дополнительной очистки ДНК применяется готовая к использованию колонка для гель-фильтрации. Могут использоваться другие колонки или методы очистки, основанные на иных принципах, если они пригодны для этой цели и эквивалентным образом применяются.

Смолу в колонке Microspin S300 HR*(10) ресуспендируют, интенсивно встряхивая на . Завинчивающуюся крышку приоткрывают, поворачивая на четверть оборота, сломав нижнюю заглушку.

Колонку Microspin S300 HR помещают в полипропиленовую реакционную пробирку на 3 . Центрифугируют при 770 g в течение 1 мин. Помещают колонку Microspin S300 HR в новую полипропиленовую реакционную пробирку на 1,5 и удаляют завинчивающуюся крышку. Медленно наносят раствор ДНК (50 ) на колонку. Центрифугируют при 770 g в течение 2 мин. Очищенная ДНК присутствует в элюате. Раствор ДНК должен храниться в холодильнике. Если раствор ДНК хранится одну - две недели, то температура 4°С достаточна; для более длительных периодов хранения необходима температура минус 20°С.

А.5.2.15.4 Количественная оценка ДНК

Если количество отчищенной ДНК образца достаточно, количественная оценка ДНК может быть проведена с использованием УФ-спектрофотометра, как описано в приложении В (раздел В.1). Концентрация ДНК также может быть оценена флюориметрически по методу PicoGreen dsDNA [17] с использованием комплекта реактивов (5.2.11.24), или эквивалентным методом.

Так как лецитина часто содержит низкое количество ДНК, для получения пригодной для амплификации соевой ДНК предпочтительно использовать ПЦР в реальном времени (см. В.3). Метод количественной оценки гена соевого лектина описан в ИСО 21570:2005 [41].

А.5.2.15.5 Оценка целостности ДНК

Целостность ДНК, полученной при экстракции, в последующем не оценивается, поскольку критерием качества экстрагированной ДНК является ее пригодность для амплификации при последующей ПЦР с использованием специфических для сои методов для последовательностей ДНК не превышающих 100 п.о.

А.5.2.15.6 Подготовка стандартов

Контрольная ДНК для калибровки выделена из соевой муки [ERM BF410a] с использованием протокола с ЦТАБ. Концентрацию ДНК оценивали флюориметрически методом PicoGreen dsDNA [17].

А.5.2.15.7 Критерии принятия или отклонения результатов

Количество амплифицируемой ДНК в пробе (в количестве копий за ПЦР) определяется посредством ПЦР в реальном времени. Достаточным условием принятия данных является, показатель если он не превышает 0,9% для содержащей ГМО ДНК.

А.5.2.15.8 Идентификация

Результат метода экстракции ДНК может быть проверен с помощью специфических для сои, справочных методик как описано в ИСО 21570:2005 [41].

А.5.2.16 Идентификация образцов

Все образцы должны быть идентифицированы.

А.5.2.17 Вычисления

Для вычисления см. 5.2.3.4.

А.5.2.18 Хранение материалов

Хранение материалов должно соответствовать ИСО/МЭК 17025 [39],

А.5.2.19 Отчет

Отчет должен быть выполнен, как определено в ИСО 24276 и других применимых стандартах (ИСО/МЭК 17025 [39]).

А.5.2.20 Меры по обеспечению безопасности

При использовании перчаток следует убедиться, что они не содержат талька. Загрязнение предотвращают при помощи стерильных расходных материалов (носики, пробирки).

А.5.2.21 Предотвращение загрязнения и вывоз отходов

См. ИСО 24276.

<< Назад		Приложение >> В (обязательное). Методы количественной оценки выделенной ДНК
	Содержание Национальный стандарт РФ ГОСТ Р ИСО 21571-2014 "Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных...

Приложение А (обязательное). Методы экстракции ДНК

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.