Приложение В (обязательное). Методы количественной оценки выделенной ДНК

Приложение В
(обязательное)

Методы количественной оценки выделенной ДНК

В.1 Основной метод ультрафиолетовой спектрометрии

B.1.1 Общие положения

В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрации ДНК в растворах.

B.1.2 Статус валидации

Настоящий метод был проверен путем кольцевого тестирования, результаты были опубликованы в [35]. Например, метод был успешно применен при межлабораторных сличениях по обнаружению ГМО, организованных Федеральным министерством общественного здравоохранения в Берне и кантональными лабораториями Базеля и Цюриха (Швейцария).

B.1.3 Принцип

Нуклеиновые кислоты в растворе поглощают ультрафиолетовый (УФ) свет в диапазоне 210 - 300 нм с максимумом поглощения на длине волны 260 нм. Поскольку ДНК, РНК и нуклеотиды имеют максимум поглощения на длине волны 260 нм, то загрязнение растворов ДНК и РНК нуклеотидами не может быть определено УФ-спектрометрией. По этой причине до определения ДНК необходимо ферментативное удаление РНК во время выделения ДНК. Также необходимо удалить олигонуклеотиды и нуклеотиды, полученные при гидролизе РНК (например, обработкой диоксидом кремния, как указано в А.4.1.7.2). Если не удалить образованные при обработке рибонуклеазой олигонуклеотиды и нуклеотиды (например, обработкой диоксидом кремния), это может привести к завышению содержания ДНК в образце. Кроме того, двухцепочечная ДНК абсорбирует меньше УФ-света по сравнению с одноцепочечной ДНК. Поскольку доля одноцепочечной ДНК в растворе неизвестна, то, чтобы избежать завышения содержания ДНК, вся ДНК в испытуемом образце превращается в одноцепочечную форму путем использования гидроксида натрия в качестве денатурирующего агента. Так как нуклеиновые кислоты не поглощают на длине волны 320 нм, показание на этой длине волны является информативным для определения фонового поглощения в результате рассеяния света и присутствия УФ-активных компонентов.

Построение калибровочного графика не является обязательным при условии, что соответствующий молярный коэффициент экстинкции выбран в зависимости от типа исследуемой нуклеиновой кислоты и/или ее целостности.

Однако необходимо периодически проверять калибровку спектрометра путем измерения концентрации эталонных растворов ДНК.

В.1.4 Область применения

Метод применим к концентрациям ДНК в диапазоне от 2 до 50 . Перед количественным анализом необходимо сделать соответствующие разбавления выделенной ДНК, подлежащей количественному определению, чтобы ее концентрация находилась в линейном диапазоне спектрометрического измерения (оптическая плотность - между 0,05 и 1).

Примечание - Следует учитывать, что остаточные соединения (например, ЦТАБ, оставшийся в результате процедуры экстрагирования ДНК) могут оказывать негативное влияние на УФ-спектрометрическое обнаружение на длине волны 260 нм. Это связано с тем, что данные соединения также поглощают на этой длине волны.

В.1.5 Реактивы

В.1.5.1 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) ().

B.1.5.2 Гидроксид натрия (NaOH).

B.1.5.3 Соляная кислота, c (HCI) = 37%-ная.

B.1.5.4 ДНК-носитель, например ДНК* спермы сельди или вилочковой железы телят.

B.1.5.5 Эталонный раствор ДНК

Основной раствор ДНК массовой концентрации 10  готовят, растворив 100 мг ДНК-носителя (В.1.5.4) в 10  буфера для разбавления (В.1.5.7). ДНК растворяется при этой концентрации очень медленно, и конечный раствор очень вязкий. Затем разбавляют этот приготовленный основной эталонный раствор ДНК буфером для разбавления до требуемой рабочей концентрации (например, 25 ).

В.1.5.6 Раствор гидроксида натрия, с (NaOH) = 2 .

В.1.5.7 Буфер для разбавления, с (Трис) = 0,01 .

Доводят значение рН до 9,0 ед. рН, используя HCI.

B.1.6 Оборудование

В.1.6.1 УФ-спектрометр, допускаются одно-, двулучевые или фотодиодные приборы.

В.1.6.2 Смеситель, например Vortex.

В.1.6.3 Сосуды для измерения, например кварцевые или пластмассовые кюветы или пластиковые ячейки (планшеты), пригодные для УФ-обнаружения на длине волны 260 нм.

Размер используемых сосудов для измерения определяется объемом раствора для измерения: полумикрокюветы - 1000 , микрокюветы - 400 , ультрамикрокюветы - 100 , кварцевые капилляры 3 - 5 . Оптический путь стандартной кюветы составляет обычно 1 см.

B.1.7 Методика

В.1.7.1 Измерение эталонного раствора ДНК

Для обеспечения правильной калибровки спектрометр проверяют путем проведения следующих измерений с использованием эталонного раствора ДНК:

- при измерении фона (контрольного раствора) измерительный сосуд заполняют только буфером для разбавления (В.1.5.7);

- при измерении эталонного раствора измерительный сосуд заполняют эталонным раствором ДНК (В.1.5.5).

Поглощение контрольного раствора и эталонного раствора ДНК измеряют для обоих случаев на длинах волн 260 и 320 нм.

В.1.7.2 Измерение испытуемого раствора ДНК неизвестной концентрации

Для приготовления контрольного раствора смешивают буфер для разбавления (В.1.5.7) с раствором гидроксида натрия (В.1.1.5.13) таким образом, чтобы была достигнута конечная молярная концентрация NaOH 0,2 . Этой смесью заполняют измерительный сосуд.

Смешивают испытуемый раствор ДНК с раствором гидроксида натрия, чтобы получить конечную концентрацию NaOH 0,2 (в случае необходимости смешивают и с буфером для разбавления). Этой смесью заполняют измерительный сосуд.

Выдерживают как контрольный раствор, так и эталонный раствор ДНК в течение 1 мин и проводят измерения при длинах волн 260 и 320 нм. Показание устойчиво в течение не менее 1 ч.

Пример 1 - Для приготовления контрольного раствора смешивают 90 мкл буфера для разбавления и 10 мкл раствора гидроксида натрия и переносят в измерительный сосуд вместимостью 100 .

Пример 2 - Для приготовления испытуемого раствора ДНК смешивают 80  буфера для разбавления или воды, 10  раствора гидроксида натрия и 10  раствора ДНК неизвестной концентрации и переносят в измерительный сосуд вместимостью 100 .

B.1.8 Оценка

Для определения фонового значения поглощения (оптической плотности) OD при длине волны 320 нм вычитают из значения поглощения при длине волны 260 нм, получая исправленное значение поглощения при 260 нм.

Если исправленное значение OD при 260 нм равняется 1,0, то расчетная концентрация ДНК составляет 50  для двухцепочечной ДНК или 37  для одноцепочечной ДНК (например, денатурированной гидроксидом натрия) соответственно.

Для получения достоверных измерений значения OD при длине волны 260 нм должны быть более 0,05.

Массовую концентрацию испытуемого раствора двухцепочечной ДНК с учетом денатурации и используемого коэффициента разбавления рассчитывают по формуле

,

(B.1)

где F - коэффициент разбавления;

- поглощение при длине волны 260 нм;

- поглощение при длине волны 320 нм;

37 - переводной коэффициент, .

Пример - Коэффициент разбавления составляет 10, значение - 0,658 и значение - 0,040:

.

В.2 Метод электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием

В.2 1 Общие положения

В настоящем приложении описывается систематический метод определения концентрации ДНК в растворах. Электрофорез ДНК в агарозном геле и окрашивание бромистым этидием (EtBr) позволяют оценить количество ДНК и в то же время проанализировать ее физическое состояние (например, степень деградации, присутствие остаточной РНК и некоторых загрязнителей). Метод также применяется в случаях, если имеется недостаточное количество ДНК для спектрометрического обнаружения или если ДНК недостаточно очищена и может содержать вещества, которые поглощают ультрафиолетовое излучение [36]. Электрофорез в геле обычно не рекомендуется применять для количественного определения ДНК в том случае, если она подверглась деградации. В этом случае следует применять другие методы.

B.2.2 Статус валидации

Этот метод на протяжении многих лет широко применялся при различных исследованиях, однако никогда не проверялся при межлабораторных исследованиях по обнаружению ГМО в пищевых продуктах.

B.2.3 Принцип

ДНК загружается на молекулярное сито (агарозный гель) и подвергается воздействию электрического поля в присутствии буферного раствора [37]. С помощью электрофореза ДНК разделяется в зависимости от ее заряда и молекулярной массы.

EtBr встраивается (интеркалирует) в ДНК и при возбуждении ультрафиолетовым светом излучает оранжевую флуоресценцию. Поскольку значение флуоресценции пропорционально общей массе ДНК, то количество ДНК в образце можно оценить путем сравнения флуоресценции, излучаемой неизвестным образцом, с флуоресценцией, излучаемой набором эталонных растворов ДНК с известным количеством ДНК. Молекулярная масса таких стандартов должна быть аналогична молекулярной массе ДНК, подлежащей количественному анализу, так как встраивание EtBr в ДНК и возникающее в результате него излучение флуоресценции также зависят от длины фрагментов ДНК. EtBr также окрашивает одноцепочечную ДНК и РНК. Для более точной оценки содержания ДНК необходимо с помощью ферментов удалить одноцепочечную ДНК и РНК.

B.2.4 Область применения

Метод применим к концентрациям ДНК в приблизительном диапазоне от 5 до 500 нг при использовании систем регистрации фотоизображений. Системы видеодокументации с камерой CCD могут обеспечить более высокую чувствительность.

B.2.5 Меры безопасности

Поскольку EtBr является мощным мутагеном и канцерогеном, при обращении с ним следует соблюдать меры предосторожности. Обязательным требованием является использование перчаток. Все растворы и гели, содержащие EtBr, перед выбросом и удалением необходимо подвергать дезактивации (см. [36]).

УФ-излучение особенно опасно для сетчатой оболочки глаза. При работе с УФ-излучением всегда необходимо надевать защитные очки или защитную маску.

B.2.6 Реактивы

Электрофорез в агарозном геле может выполняться с применением как буфера ТАЕ, так и буфера ТВЕ.

Применение этого метода не требует наличия реактивов степени чистоты, применяемой в молекулярной микробиологии. Используемые в данном методе растворы обычно не нуждаются в автоклавировании.

B.2.6.1 Агароза, пригодная для электрофореза ДНК и разделения молекул ДНК предполагаемого размера.

B.2.6.2 Борная кислота (), только для буферной системы ТВЕ.

B.2.6.3 Бромфеноловый синий () и/или ксилол цианол FF ().

B.2.6.4 Стандарт количества ДНК соответствующей молекулярной массы (линейная ДНК фага Лямбда для высокомолекулярных масс ДНК и подвергшаяся рестрикции низкомолекулярная ДНК фага Лямбда для низкомолекулярных масс ДНК).

B.2.6.5 Стандарт молекулярной массы ДНК, например коммерческий препарат, содержащий фрагменты ДНК от очень высокой до очень низкой молекулярной массы.

B.2.6.6 Ледяная уксусная кислота (), только для буферной системы ТАЕ.

B.2.6.7 Этилендиаминтетрауксусной кислоты двунатриевая соль (ЭДТА) ().

B.2.6.8 Бромистый этидий (EtBr) ().

B.2.6.9 Глицерин ().

B.2.6.10 Ацетат натрия (), только для буферной системы ТАЕ.

В.2 6.11 Соляная кислота, с (HCI) = 37%-ная.

B.2.6.12 Гидроксид натрия (NaOH).

B.2.6.13 Трис(оксиметил) аминометан (Трис) ().

B.2.6.14 Буферный раствор ТАЕ (1), с (Трис) = 0,050 , с () = 20 , с (ЭДТА) = 0,001

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН ледяной уксусной кислотой или NaOH. Целесообразно готовить буферный раствор ТАЕ в виде концентрированного основного раствора (максимум 50-кратной концентрации). Не следует использовать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для электрофореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой может выполняться непосредственно перед их использованием.

B.2.6.15 Трис боратный буферный раствор (ТВЕ) (0,5), с (Трис) = 0,055 , с (борная кислота) = 0,055 , с (ЭДТА) = 0,001 .

Доводят значение рН до 8,0 ед. рН, используя HCI или NaOH. Целесообразно готовить буферный раствор ТВЕ в виде концентрированного основного раствора (максимум 10-кратной концентрации. Не следует использовать буфер при появлении видимого осадка. Разбавление концентрированных буферных растворов для электрофореза нестерильной, однократно перегнанной или деионизированной водой может выполняться непосредственно перед их использованием.

B.2.6.16 Буферный раствор для загрузки пробы (5), в буферном растворе для электрофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15) с (глицерин) = 50%, с (бромфеноловый синий) = 2,5 и/или с (ксилол цианол) = 2,5 .

B.2.6.17 Раствор бромистого этидия, с (EtBr) = 0,5 

Целесообразно хранить раствор бромистого этидия в виде концентрата (например, 10 ) при температуре 5°С в темноте (EtBr чувствителен к свету). Также желательно избегать взвешивания EtBr. Основной раствор необходимо готовить путем растворения порошка EtBr, уже находящегося в сосуде, соответствующим количеством воды или применяя предварительно взвешенные таблетки EtBr. Растворение EtBr следует выполнять в месте, защищенном отсвета, перемешивать при комнатной температуре. Обычно это занимает приблизительно 1 ч.

В.2.7 Оборудование

B.2.7.1 Печь микроволновая или кипящая водяная баня.

B.2.7.2 Оборудование для электрофореза в агарозном геле со вспомогательными принадлежностями и источником питания.

B.2.7.3 Ультрафиолетовый трансоблучатель или лампа, предпочтительно с длиной волны 312 нм.

Альтернативно могут использоваться оборудование для колоночной хроматографии нуклеиновых кислот и соответствующая система обнаружения или другие аналогичные системы.

B.2.7.4 Регистрирующий прибор, например система фотодокументации с пленкой 3000 ASA и УФ-фильтром, соответствующим флуоресценции, излучаемой EtBr.

Альтернативно могут использоваться система видеодокументации с камерой CCD, соответствующий УФ-фильтр и (при необходимости) программное обеспечение количественного анализа.

В.2.3 Методика

B.2.8.1 Общие положения

Электрофорез в агарозном геле может выполняться с применением как буфера ТАЕ, так и буфера ТВЕ. Допускается использовать один и тот же буфер для растворения агарозы и заполнения ячейки для электрофореза.

B.2.8.2 Приготовление агарозного геля

Гель должен быть не толще 1 см.

Концентрация агарозы и ее качество определяют разрешающую способность геля. Для количественного анализа ДНК с высокой молекулярной массой используются массовые концентрации агарозы от 8 до 10 . Для количественного анализа ДНК с низкой молекулярной массой (например, деградированной или подвергнутой действию рестриктазы) используются более высокие концентрации агарозы (до 40 ) [38].

Взвешивают соответствующее количество агарозы (В.2.6.1) и добавляют ее в буферный раствор для электрофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15). Кипятят раствор в микроволновой печи или водяной бане (В.2.7.1) до полного растворения агарозы. Дополняют объем, потерянный в результате выпаривания, эквивалентным количеством воды, перемешивают при взбалтывании (следует избегать захвата пузырьков воздуха), охлаждают раствор до температуры приблизительно 60°С и Выдерживают его при этой температуре до использования. Готовят гелевую подложку (лоток для геля) с соответствующей гребенкой для пробы, расположенной в правильном положении. Наливают раствор агарозы на гелевый лоток и дают возможность гелю загустеть при комнатной температуре (обычно рекомендуется в течение 1 ч).

B.2.8.3 Приготовление пробы ДНК

Смешивают растворы пробы ДНК (например, 5 - 10 ) с приблизительно 20% (относительно окончательного объема пробы) буфера для загрузки (В.2.6.16) (например, добавляют 2,5  буфера для загрузки к 10  пробы ДНК), перемешивают и вносят смесь в лунки (гнезда) для пробы с помощью микропипетки. Если предполагается, что неизвестные образцы будут очень концентрированными, то необходимо разбавить их перед загрузкой в гель.

Для определения размера выделенных фрагментов ДНК добавляют буфер для загрузки пробы (В.2.6.16) (в соотношении 20% относительно объема пробы) к соответствующему количеству стандарта молекулярной массы ДНК (В.2.6.5) и параллельно проводят электрофорез.

Для оценки концентрации неизвестного образца следует анализировать параллельно стандартные образцы количества ДНК. Такие образцы содержат известные количества стандарта ДНК (В.2.6.4) (в пределах динамической области применения метода, т.е. от 5 до 500 нг), разбавленного водой или буфером для электрофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15). Рекомендуется использовать стандарты количества, содержащие по меньшей мере пять калибровочных точек (т.е. различные количества ДНК).

B.2.8.4 Проведение электрофореза

Осторожно вынимают гребенку для образцов из геля. Переносят гель (вместе с лотком) в ячейку для электрофореза таким образом, чтобы лунки находились как можно ближе к катоду (отрицательному электроду). Заполняют ячейку буфером для электрофореза (В.2.6.14 или В.2.6.15). Покрывают гель слоем того же буфера толщиной 2 мм и загружают анализируемые пробы с помощью микропипетки.

Выполняют электрофорез при комнатной температуре при соответствующем напряжении и энергоемкости (обычно рекомендуется максимальное неизменное напряжение 5 В/см для расстояния между электродами). В указанных условиях ДНК имеет отрицательный заряд, поэтому она мигрирует от катода к аноду. Время электрофореза зависит от требуемого расстояния миграции, тока, вырабатываемого источником энергии, электроэндоосмоса и концентрации агарозы в геле.

B.2.8.5 Окрашивание

После завершения электрофореза выдерживают гель в течение 15 - 50 мин в растворе бромистого этидия (В.2.6.17) при комнатной температуре, если возможно, в темноте (и/или в сосуде из нержавеющей стали с крышкой), осторожно встряхивая.

При необходимости уменьшения фонового окрашивания необходимо поместить гель в воду на 10 - 30 мин.

Как вариант можно добавлять EtBr к гелю перед его разливом. В этом случае добавляют EtBr к гелю до конечной массовой концентрации 0,01 мг на миллиметр геля, охлажденного до температуры 60°С.

Если гель разливается вместе с бромистым этидием, загружают неизвестный образец и стандарт количества ДНК (В.2.6.4) в отдельные лунки, образованные той же гребенкой на том же геле. Иначе количество бромистого этидия будет различным для образца и стандарта, что приведет к ошибочным результатам количественного анализа. Чтобы свести к минимуму проблемы, связанные с движением EtBr в геле, некоторое количество EtBr может быть также добавлено к буферу для электрофореза (в ячейку). После электрофореза в геле обычно не требуется проведения стадии удаления окрашивания.

В данном случае после окончания электрофореза удаление окрашивания обычно не проводится.

B.2.8.6 Регистрация геля

Переносят гель на поверхность трансоблучателя, включают УФ-свет и регистрируют флуоресценцию ДНК с помощью фото- или видеозаписи.

В.2.9 Оценка/интерпретация результатов

Содержание ДНК в образце оценивают, сравнивая неизвестные образцы с образцами стандартного количества ДНК, которые подвергаются электрофорезу параллельно. Эта оценка может выполняться визуально или с помощью программного обеспечения количественного анализа, пригодного для расчета адекватной калибровочной кривой.

В.3 Метод ПЦР в реальном времени для количественного анализа выделенной ДНК

При выделении ДНК из продуктов с низким содержанием ДНК количественный анализ не всегда возможно провести обычными физическими методами (например, методами, описанными в настоящем приложении) по причине их недостаточной чувствительности. Если необходим такой количественный анализ, то можно использовать метод ПЦР в реальном времени. Этот метод также дает информацию относительно способности применения выделенных молекул ДНК для ПЦР которую нельзя получить путем выполнения физических измерений концентраций ДНК. Более подробно метод описан в ИСО 21570.