Приложение В (обязательное). Методы культивирования тест-организмов

Приложение В
(обязательное)

Методы культивирования тест-организмов

В.1 Условия культивирования тест-организмов. Общие требования.

В.1.1 Исходный материал для культивирования тест-организмов Daphnia magna Straus получают в лабораториях, занимающихся тестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности. Чувствительность культур к модельному токсиканту должна соответствовать установленному в настоящем стандарте диапазону за 24 ч (методы А и В).

Тест-организмы культивируют и содержат в климатостате, в инкубаторе или в помещении с регулируемой температурой (202)°С.

При этом обеспечивают естественное или искусственное освещение так, чтобы соблюдались следующие периоды выдержки: 16 ч - воздействие света при освещенности 500 - 1000 л к, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Тест-организмы Daphnia magna Straus необходимо защищать от воздействия прямого солнечного света.

Тест-организмы и культивационная вода, в которой проводят их культивирование, должны содержаться в емкостях только из стекла или полимерного материала, изготовленного без использования пластификатора.

Примечания

1 Тест-организмы - пресноводные ракообразные Daphnia magna Straus: имеют широкое географическое распространение, обладают коротким жизненным циклом и требуют минимум пространства и оборудования для культивирования и проведения тестирования. Тест-организмы можно культивировать постоянно в лабораторных условиях.

2 Развитие ракообразных Daphnia magna Straus проходит через три стадии: новорожденный организм, молодь и взрослые особи. При температуре 20°С развитие только что вылупившихся новорожденных организмов до взрослой стадии проходит через 7 сут. Новорожденные дафнии выпускаются непосредственно из яйцевого мешка женской особью Daphnia magna Straus в течение 1 - 2 сут.

В.1.2 Вода для культивирования тест-организмов по 5.3.2 и 5.2 настоящего стандарта (далее - культивационная вода) должна соответствовать условиям тестирования [см. 5.3.2 и Е.1 (приложение Е)].

В.1.3 Емкости, применяемые для культивирования тест-организмов, должны быть оснащены свободными или перфорированными крышками, чтобы уменьшить испарение, но обеспечить газообмен.

В.1.4 Емкости тщательно моют при каждой замене культивационной воды.

В.1.5 В качестве корма используют культуры пресноводных одноклеточных водорослей Scenedesmus qvadricauda или Chloreila vulgaris (десятисуточную).

В.2 Условия подготовки к тестированию Daphnia magna Straus.

В.2.1 Оборудование и процедура получения молоди

Для тестирования используют околосуточных Daphnia magna Straus (синхронизированная культура), которых получают в лаборатории следующим способом:

- в стакан вместимостью 500  с культивационной водой из емкости с маточной культурой помещают 40 шт. взрослых особей Daphnia magna Straus, кормят по В 2.3 и выдерживают 1 - 2 сут.

Примечание - Культивационную воду готовят по 5.3.2 или приложению Е;

- через одни сутки новорожденные организмы, по мере их выклева в течение суток, отбирают трубочкой и помещают в чистый стакан с культивационной водой;

- затем околосуточную молодь (синхронизированную культуру) используют в эксперименте.

В.2.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции тест-организмов при подготовке молоди к тестированию.

В течение 1 - 8 ч накопившиеся новорожденные тест-организмы переносят пипеткой в отдельный сосуд с культивационной водой и используют для тестирования.

Предварительную адаптацию к культивационной воде неонатов Daphnia magna Straus не проводят.

В.2.3 Кормление

Околосуточную молодь Daphnia magna Straus при тестировании не кормят.

В.3 Условия культивирования маточной культуры Daphnia magna Straus по методу А

В.3.1 Для культивирования маточной культуры Daphnia magna Straus используют небольшие стеклянные емкости (например, кристаллизаторы) объемом 1 - 3 , плотность посадки 20 - 25 особей на 1 .

Емкости для культивирования заполняют на 3/4 объема культивационной водой и помещают туда самок дафний среднего размера с выводковыми камерами, заполненными эмбрионами и неплотно прикрывают пластинами из стекла или оргстекла толщиной не менее 6 мм (от попадания пыли и для уменьшения испарения). Для пересадки в емкости для культивирования допускается отбирать взрослых самок с использованием фильтрования культуры через крупное сито с отверстиями размеров ячеек 1800 - 2200 мкм.

Маточную культуру Daphnia magna Straus поддерживают в одной или двух емкостях. Ежедневно с поверхности воды емкостей, в которых культивируют тест-организмы, марлевой салфеткой снимают дрожжевую и бактериальную пленку. После этого воду вместе с рачками осторожно переливают в чистую емкость так, чтобы накопившийся осадок остался на дне. В чистую емкость добавляют свежую культивационную воду.

Таким способом, ежедневно проводят очистку поверхности воды и дна емкости, в которой культивируются рачки. Кормление маточной культуры дафний осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями п. Б.3.3. Содержание растворенного кислорода в воде емкости должно быть не менее 6 мг /, что достигается приготовлением культивационной воды по 5.3.2 и регулярной пересадкой дафний в свежую культивационную воду. Аэрирование воды в емкостях с дафниями при культивировании не допускается.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер названного пункта следует читать как "п. В.3.3"

Один или два раза в неделю осуществляют пересадку маточной культуры в свежую культивационную воду. Частоту пересадки определяют плотностью маточной культуры и содержанием растворенного кислорода в культивируемых емкостях (плотность маточной культуры 20 - 25 особей на 1 культивационной воды).

Не допускается использование молоди маточной культуры для тестирования.

Появившуюся молодь в необходимом количестве отсаживают в отдельные емкости от поколения к поколению. Когда вновь народившиеся тест-организмы начинают размножаться, материнские особи удаляют. Каждое поколение маркируют и на емкости ставят дату рождения. Одновременно в лаборатории содержат культуры двух поколений.

При культивировании и проведении токсикологических опытов необходимо поддерживать непрерывное партеногенетическое размножение тест-организмов, учитывая особенности биологического цикла их развития.

Длительное культивирование тест-организмов в лабораторных условиях позволяет устанавливать пределы изменчивости основных биологических показателей в зависимости от сезона. В оптимальных условиях содержания выживаемость тест-организмов не зависит от времени года. Средние значения плодовитости за 30 сут составляют от 60 до 170 экземпляров молоди на одну самку (за это время получают 7 - 8 пометов). Могут наблюдаться повторяющиеся снижения плодовитости тест-организмов в зимний (ноябрь - январь) и летний (июнь - июль) периоды. Длительность культивирования тест-организмов в лаборатории в оптимальных условиях даже в течение 10 лет не влияет на результаты опытов.

Этот вид является бетамезосапробом, перенося осолонение до 6 . Оптимальное содержание кислорода для тест-организмов составляет 7 - 8 мг однако тест-организмы способны переносить снижение концентрации кислорода до 2 мг .

В.3.2 Адаптация Daphnia magna Straus к среде с повышенной минерализацией

При необходимости биотестирования проб воды или различных водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов, донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв с общим содержанием солей свыше 3 выращивают культуру Daphnia magna Straus, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют Daphnia magna Straus, минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. В начале его вносят из расчета 500 . Затем постепенно через неделю минерализацию воды повышают на 250  и повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не свыше 6 с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно.

Эта же среда служит контролем при тестировании и в качестве воды для разбавлений. Адаптированную культуру Daphnia magna Straus к повышенному содержанию солей нельзя использовать для тестирования вод с более низкой минерализацией.

Оптимальные значения культивационной воды рН составляет 7,0 - 8,0, однако временные изменения рН в пределах 5,8 - 9,0 не подавляют существенным образом жизнедеятельность тест-организмов.

В.3.3 Кормление

Тест-организмы Daphnia magna Straus кормят двумя видами одноклеточных водорослей, выращиваемых в лабораторных условиях, Scenedesmus qvadricauda и Chiorella vulgaris. Эти водоросли выращивают с использованием асептической технологии, чтобы исключить заражение культуры бактериями, водорослями и простейшими организмами. Для выращивания водорослей Scenedesmus qvadricauda и Chiorella vulgaris используют питательную среду Прата.

Исходные растворы N 1 - N 4 для приготовления питательной среды Прата готовят на дистиллированной воде из реактивов, вносимых в количествах, приведенных в таблице В.1.

Исходные растворы хранят при температуре 0°С - 4°С не более года.

Питательную среду Прата готовят следующим способом: в мерную стеклянную колбу вместимостью 1000  вносят дистиллированную воду до метки, затем переливают в колбу вместимостью 2000  и добавляют по 1  исходных растворов N 1, N 2 и N 3 (см. таблицу В.3), перемешивают, плотно закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком, затем кипятят на водяной бане в течение 15 мин, после чего содержимое охлаждают. После охлаждения через 24 ч добавляют 1  исходного раствора N 4, снова перемешивают, плотно закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком.

Таблица В.1 - Состав питательной среды Прата для метода А

Номер исходного раствора	Наименование реактива	Массовая концентрация реактива в исходном растворе,	Массовая концентрация реактива в питательной среде,
1	Калий азотнокислый по ГОСТ 4217 ()	100000	100,0
2	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523 ()	10000	10,0
3	Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493 ()	10000	10,0
4	Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147 ()	1000	1,0

Приготовленную питательную среду Прата хранят в условиях, исключающих воздействие света, при температуре (205)°С не более одного года.

Культивирование водорослей для кормления тест-организмов проводят следующим способом: в колбу объемом 500  с питательной средой (объем среды - 300 ) добавляют 15  суспензии водорослей из маточной культуры и выращивают водоросли [при температуре (202)°С и освещенности 3000 лк] в течение 10 сут. Через 10 сут, когда плотность клеток обычно достигает максимума ( - для Scenedesmus qvadricauda и Chlorella vulgaris), культуры водорослей сгущают (концентрируют) с помощью центрифуги и размешивают до состояния суспензии, разбавляя дистиллированной водой. Таким способом получают суспензию водорослей, предназначенную для корма тест-организмов, плотность которой достигает примерно 5 для Scenedesmus qvadricauda и Chlorella vulgaris. Суспензию водорослей, предназначенную для кормления тест-организмов, хранят в холодильнике при температуре от 0°С до 4°С не более 7 сут.

В качестве дополнительного корма для маточных культур дафний используют сухие пекарские дрожжи. Для приготовления суспензии берут 1 г сухих дрожжей и растворяют в 100  дистиллированной воды. Затем полученную суспензию вносят в аквариум с дафниями 1 - 2 раза в неделю из расчета 3  (1%-ной суспензии) на 1 . Суспензию дрожжей хранят в холодильнике не более 3 сут.

Допускается использовать и другие питательные среды (например, Успенского N 1 или Тамия). Характеристики используемых питательных сред приведены в таблице В.2.

Таблица В.2. - Характеристики используемых питательных сред для культивирования кормовых водорослей (метод А)

Номер исходного раствора	Наименование реактива	Массовая концентрация реактива в питательной среде Успенского N 1,	Массовая концентрация реактива в питательной среде Тамия,
1	Калий азотнокислый по ГОСТ 4217 ()	0,025	5,00
2	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523 ()	0,025	2,50
3	Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493 ()	-	-
4	Калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный по ГОСТ 4198 ()	0,025	1,25
5	Калий углекислый или (двууглекислый калий) ( или )	0,0345	-
6	Железо сернокислое 7-водное по ГОСТ 4148 ()	-	0,003
7	Железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147 ()	-	-
8	Кальций азотнокислый 4-водный по ГОСТ 4142 ()	0,144	-
Микро- элементы	Раствор N 1	-	-
	Раствор N 2	-	-

Примечания

1 Состав раствора N 1: борная кислота () - 2,86 ; хлористый марганец 4-водный () - 1, 81 ; сернокислый цинк 7-водный () - 0,222 . Раствор N 2: окись молибдена () - 17, 64 ; аммоний ваннадиевокислый () - 22,96 . Объем каждого из добавляемых растворов N 1 и N 2 в питательную среду составляет 1 .

2 Питательные среды для водорослей готовят на дистиллированной воде. Растворы солей микроэлементов можно добавлять во все среды независимо оттого, указано это в прописи или нет.

В.4 Условия культивирования Daphnia magna Straus (метод В)

Общие рекомендации для культивирования тест-организмов

В.4.1 Исходная плотность культуры должна быть в пределах 25 - 50 организмов в 1 .

Примечание - Исходная плотность культуры должна быть на уровне культуры, используемой в опыте. Например плотность культуры 25 тест-организмов в 1 можно использовать