Приложение В (обязательное). Методы культивирования тест-организмов

Приложение В
(обязательное)

Методы культивирования тест-организмов

В.1 Условия культивирования тест-организмов. Общие требования.

В.1.1 Исходный материал для культивирования тест-организмов Daphnia magna Straus получают в лабораториях, занимающихся тестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности. Чувствительность культур к модельному токсиканту должна соответствовать установленному в настоящем стандарте диапазону за 24 ч (методы А и В).

Тест-организмы культивируют и содержат в климатостате, в инкубаторе или в помещении с регулируемой температурой (202)°С.

При этом обеспечивают естественное или искусственное освещение так, чтобы соблюдались следующие периоды выдержки: 16 ч - воздействие света при освещенности 500 - 1000 л к, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Тест-организмы Daphnia magna Straus необходимо защищать от воздействия прямого солнечного света.

Тест-организмы и культивационная вода, в которой проводят их культивирование, должны содержаться в емкостях только из стекла или полимерного материала, изготовленного без использования пластификатора.

Примечания

1 Тест-организмы - пресноводные ракообразные Daphnia magna Straus: имеют широкое географическое распространение, обладают коротким жизненным циклом и требуют минимум пространства и оборудования для культивирования и проведения тестирования. Тест-организмы можно культивировать постоянно в лабораторных условиях.

2 Развитие ракообразных Daphnia magna Straus проходит через три стадии: новорожденный организм, молодь и взрослые особи. При температуре 20°С развитие только что вылупившихся новорожденных организмов до взрослой стадии проходит через 7 сут. Новорожденные дафнии выпускаются непосредственно из яйцевого мешка женской особью Daphnia magna Straus в течение 1 - 2 сут.

В.1.2 Вода для культивирования тест-организмов по 5.3.2 и 5.2 настоящего стандарта (далее - культивационная вода) должна соответствовать условиям тестирования [см. 5.3.2 и Е.1 (приложение Е)].

В.1.3 Емкости, применяемые для культивирования тест-организмов, должны быть оснащены свободными или перфорированными крышками, чтобы уменьшить испарение, но обеспечить газообмен.

В.1.4 Емкости тщательно моют при каждой замене культивационной воды.

В.1.5 В качестве корма используют культуры пресноводных одноклеточных водорослей Scenedesmus qvadricauda или Chloreila vulgaris (десятисуточную).

В.2 Условия подготовки к тестированию Daphnia magna Straus.

В.2.1 Оборудование и процедура получения молоди

Для тестирования используют околосуточных Daphnia magna Straus (синхронизированная культура), которых получают в лаборатории следующим способом:

- в стакан вместимостью 500  с культивационной водой из емкости с маточной культурой помещают 40 шт. взрослых особей Daphnia magna Straus, кормят по В 2.3 и выдерживают 1 - 2 сут.

Примечание - Культивационную воду готовят по 5.3.2 или приложению Е;

- через одни сутки новорожденные организмы, по мере их выклева в течение суток, отбирают трубочкой и помещают в чистый стакан с культивационной водой;

- затем околосуточную молодь (синхронизированную культуру) используют в эксперименте.

В.2.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции тест-организмов при подготовке молоди к тестированию.

В течение 1 - 8 ч накопившиеся новорожденные тест-организмы переносят пипеткой в отдельный сосуд с культивационной водой и используют для тестирования.

Предварительную адаптацию к культивационной воде неонатов Daphnia magna Straus не проводят.

В.2.3 Кормление

Околосуточную молодь Daphnia magna Straus при тестировании не кормят.

В.3 Условия культивирования маточной культуры Daphnia magna Straus по методу А

В.3.1 Для культивирования маточной культуры Daphnia magna Straus используют небольшие стеклянные емкости (например, кристаллизаторы) объемом 1 - 3 , плотность посадки 20 - 25 особей на 1 .

Емкости для культивирования заполняют на 3/4 объема культивационной водой и помещают туда самок дафний среднего размера с выводковыми камерами, заполненными эмбрионами и неплотно прикрывают пластинами из стекла или оргстекла толщиной не менее 6 мм (от попадания пыли и для уменьшения испарения). Для пересадки в емкости для культивирования допускается отбирать взрослых самок с использованием фильтрования культуры через крупное сито с отверстиями размеров ячеек 1800 - 2200 мкм.

Маточную культуру Daphnia magna Straus поддерживают в одной или двух емкостях. Ежедневно с поверхности воды емкостей, в которых культивируют тест-организмы, марлевой салфеткой снимают дрожжевую и бактериальную пленку. После этого воду вместе с рачками осторожно переливают в чистую емкость так, чтобы накопившийся осадок остался на дне. В чистую емкость добавляют свежую культивационную воду.

Таким способом, ежедневно проводят очистку поверхности воды и дна емкости, в которой культивируются рачки. Кормление маточной культуры дафний осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями п. Б.3.3. Содержание растворенного кислорода в воде емкости должно быть не менее 6 мг /, что достигается приготовлением культивационной воды по 5.3.2 и регулярной пересадкой дафний в свежую культивационную воду. Аэрирование воды в емкостях с дафниями при культивировании не допускается.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер названного пункта следует читать как "п. В.3.3"

Один или два раза в неделю осуществляют пересадку маточной культуры в свежую культивационную воду. Частоту пересадки определяют плотностью маточной культуры и содержанием растворенного кислорода в культивируемых емкостях (плотность маточной культуры 20 - 25 особей на 1 культивационной воды).

Не допускается использование молоди маточной культуры для тестирования.

Появившуюся молодь в необходимом количестве отсаживают в отдельные емкости от поколения к поколению. Когда вновь народившиеся тест-организмы начинают размножаться, материнские особи удаляют. Каждое поколение маркируют и на емкости ставят дату рождения. Одновременно в лаборатории содержат культуры двух поколений.

При культивировании и проведении токсикологических опытов необходимо поддерживать непрерывное партеногенетическое размножение тест-организмов, учитывая особенности биологического цикла их развития.

Длительное культивирование тест-организмов в лабораторных условиях позволяет устанавливать пределы изменчивости основных биологических показателей в зависимости от сезона. В оптимальных условиях содержания выживаемость тест-организмов не зависит от времени года. Средние значения плодовитости за 30 сут составляют от 60 до 170 экземпляров молоди на одну самку (за это время получают 7 - 8 пометов). Могут наблюдаться повторяющиеся снижения плодовитости тест-организмов в зимний (ноябрь - январь) и летний (июнь - июль) периоды. Длительность культивирования тест-организмов в лаборатории в оптимальных условиях даже в течение 10 лет не влияет на результаты опытов.

Этот вид является бетамезосапробом, перенося осолонение до 6 . Оптимальное содержание кислорода для тест-организмов составляет 7 - 8 мг однако тест-организмы способны переносить снижение концентрации кислорода до 2 мг .

В.3.2 Адаптация Daphnia magna Straus к среде с повышенной минерализацией

При необходимости биотестирования проб воды или различных водных вытяжек из проб отработанных буровых растворов, донных отложений, твердых промышленных отходов, грунтов и почв с общим содержанием солей свыше 3 выращивают культуру Daphnia magna Straus, адаптированную к повышенной минерализации среды. Для этого в воду, в которой культивируют Daphnia magna Straus, минерализация которой известна, постепенно порциями добавляют хлористый натрий. В начале его вносят из расчета 500 . Затем постепенно через неделю минерализацию воды повышают на 250  и повторяют каждую неделю до тех пор, пока содержание солей в среде не достигнет нужного уровня (но не свыше 6 с учетом начальной минерализации). В дальнейшем достигнутый уровень минерализации среды поддерживают постоянно.

Эта же среда служит контролем при тестировании и в качестве воды для разбавлений. Адаптированную культуру Daphnia magna Straus к повышенному содержанию солей нельзя использовать для тестирования вод с более низкой минерализацией.

Оптимальные значения культивационной воды рН составляет 7,0 - 8,0, однако временные изменения рН в пределах 5,8 - 9,0 не подавляют существенным образом жизнедеятельность тест-организмов.

В.3.3 Кормление

Тест-организмы Daphnia magna Straus кормят двумя видами одноклеточных водорослей, выращиваемых в лабораторных условиях, Scenedesmus qvadricauda и Chiorella vulgaris. Эти водоросли выращивают с использованием асептической технологии, чтобы исключить заражение культуры бактериями, водорослями и простейшими организмами. Для выращивания водорослей Scenedesmus qvadricauda и Chiorella vulgaris используют питательную среду Прата.

Исходные растворы N 1 - N 4 для приготовления питательной среды Прата готовят на дистиллированной воде из реактивов, вносимых в количествах, приведенных в таблице В.1.

Исходные растворы хранят при температуре 0°С - 4°С не более года.

Питательную среду Прата готовят следующим способом: в мерную стеклянную колбу вместимостью 1000  вносят дистиллированную воду до метки, затем переливают в колбу вместимостью 2000  и добавляют по 1  исходных растворов N 1, N 2 и N 3 (см. таблицу В.3), перемешивают, плотно закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком, затем кипятят на водяной бане в течение 15 мин, после чего содержимое охлаждают. После охлаждения через 24 ч добавляют 1  исходного раствора N 4, снова перемешивают, плотно закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком.

Таблица В.1 - Состав питательной среды Прата для метода А

Номер исходного раствора	Наименование реактива	Массовая концентрация реактива в исходном растворе,	Массовая концентрация реактива в питательной среде,
1	Калий азотнокислый по ГОСТ 4217 ()	100000	100,0
2	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523 ()	10000	10,0
3	Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493 ()	10000	10,0
4	Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147 ()	1000	1,0

Приготовленную питательную среду Прата хранят в условиях, исключающих воздействие света, при температуре (205)°С не более одного года.

Культивирование водорослей для кормления тест-организмов проводят следующим способом: в колбу объемом 500  с питательной средой (объем среды - 300 ) добавляют 15  суспензии водорослей из маточной культуры и выращивают водоросли [при температуре (202)°С и освещенности 3000 лк] в течение 10 сут. Через 10 сут, когда плотность клеток обычно достигает максимума ( - для Scenedesmus qvadricauda и Chlorella vulgaris), культуры водорослей сгущают (концентрируют) с помощью центрифуги и размешивают до состояния суспензии, разбавляя дистиллированной водой. Таким способом получают суспензию водорослей, предназначенную для корма тест-организмов, плотность которой достигает примерно 5 для Scenedesmus qvadricauda и Chlorella vulgaris. Суспензию водорослей, предназначенную для кормления тест-организмов, хранят в холодильнике при температуре от 0°С до 4°С не более 7 сут.

В качестве дополнительного корма для маточных культур дафний используют сухие пекарские дрожжи. Для приготовления суспензии берут 1 г сухих дрожжей и растворяют в 100  дистиллированной воды. Затем полученную суспензию вносят в аквариум с дафниями 1 - 2 раза в неделю из расчета 3  (1%-ной суспензии) на 1 . Суспензию дрожжей хранят в холодильнике не более 3 сут.

Допускается использовать и другие питательные среды (например, Успенского N 1 или Тамия). Характеристики используемых питательных сред приведены в таблице В.2.

Таблица В.2. - Характеристики используемых питательных сред для культивирования кормовых водорослей (метод А)

Номер исходного раствора	Наименование реактива	Массовая концентрация реактива в питательной среде Успенского N 1,	Массовая концентрация реактива в питательной среде Тамия,
1	Калий азотнокислый по ГОСТ 4217 ()	0,025	5,00
2	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523 ()	0,025	2,50
3	Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493 ()	-	-
4	Калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный по ГОСТ 4198 ()	0,025	1,25
5	Калий углекислый или (двууглекислый калий) ( или )	0,0345	-
6	Железо сернокислое 7-водное по ГОСТ 4148 ()	-	0,003
7	Железо (III) хлорид 6-водный по ГОСТ 4147 ()	-	-
8	Кальций азотнокислый 4-водный по ГОСТ 4142 ()	0,144	-
Микро- элементы	Раствор N 1	-	-
	Раствор N 2	-	-

Примечания

1 Состав раствора N 1: борная кислота () - 2,86 ; хлористый марганец 4-водный () - 1, 81 ; сернокислый цинк 7-водный () - 0,222 . Раствор N 2: окись молибдена () - 17, 64 ; аммоний ваннадиевокислый () - 22,96 . Объем каждого из добавляемых растворов N 1 и N 2 в питательную среду составляет 1 .

2 Питательные среды для водорослей готовят на дистиллированной воде. Растворы солей микроэлементов можно добавлять во все среды независимо оттого, указано это в прописи или нет.

В.4 Условия культивирования Daphnia magna Straus (метод В)

Общие рекомендации для культивирования тест-организмов

В.4.1 Исходная плотность культуры должна быть в пределах 25 - 50 организмов в 1 .

Примечание - Исходная плотность культуры должна быть на уровне культуры, используемой в опыте. Например плотность культуры 25 тест-организмов в 1 можно использовать для проведения опытов с 5 тест-организмами в 200  опытного раствора.

Культуру Daphnia magna Straus следует кормить одноклеточными водорослями (Scenedesmus qvadricauda или Chlorella vulgaris) из лабораторной культуры. Водоросли для корма должны быть в экспоненциальной фазе роста. Культивируемые для кормления Daphnia magna Straus одноклеточные водоросли можно использовать до тех пор, пока они не будут проявлять признаков нарушения (деградации) популяции. Кормовые водоросли не следует хранить долгое время при комнатной температуре, т.к. это приведет к ухудшению состояния культуры водорослей. Ее следует хранить в холодильнике в темноте или даже можно заморозить и кормить дафний до тех пор, пока не ухудшится их состояние и снизится репродукция. Нельзя допускать передозировку при кормлении. Культура Daphnia magna Straus должна получать 0,1 - 0,2 мг углерода в расчете на 1 организм в день. Для того чтобы избежать попадания среды культивирования водорослей в культуру дафний, рекомендуется отделить водоросли от культуральной среды и перенести их в среду культивирования дафний.

При выращивании маточной культуры Daphnia magna Straus необходимо поддерживать постоянный режим культивирования. Среду следует менять, не менее чем 2 - 3 раза в неделю. Переносят взрослых особей в чистый сосуд с новой средой и отделяют вылупившиеся тест-организмы от взрослых особей. Удаляют шкурки тест-организмов, сбрасываемые при линьке, мертвых или обесцвеченных животных, а также остатки корма.

Культивирование Daphnia magna Straus осуществляют при рассеянном дневном свете или искусственном освещении с периодичностью свет - темнота соответственно 16 и 8 ч. Температуру воздуха поддерживают в пределах (202)°С, в воздухе не должны присутствовать токсичные для дафний пары и пыль.

В.4.2 Культивирование Daphnia magna Straus для получения покоящихся (зимних) яиц

В.4.2.1 Жизненный цикл Daphnia magna Straus (рисунок В.1)

В природе дафнии могут размножаться как бесполым, так и половым путем.

Рисунок В.1 - Цикл развития Daphnia magna Straus

Однако в интенсивных культурах дафнии размножаются только бесполым способом, при этом рождаются только (диплоидные) самки. Взрослые дафнии выметывают партеногенетические яйца, которые развиваются в дорзальной (спинной) выводковой камере, из которых получается живое потомство. В процессе роста молодь дафний проходит последовательные ювенильные стадии (рисунок В.1) и только после этого дафнии начинают продуцировать яйца.

При определенных условиях внешней среды (которые в научной литературе называют "стрессовые") дафнии переходят от бесполого к половому способу размножения, в результате чего образуются (гаплоидные) самцы, а также (гаплоидные) яйца, которые оплодотворяются самцами.

В дальнейшем у самок образуется защитное дорзальное седлышко (эфиппиум), в котором размещаются два оплодотворенных яйца (покоящиеся или зимние яйца).

В.4.2.2 - Жизненный цикл Daphnia magna Straus

При очередной линьке эфиппиум отделяется вместе с яйцами и падает на дно. Зимние яйца обычно проходят стадию покоя (она может занимать несколько месяцев), в течение которой яйца не реагируют ни на какие внешние воздействия, стимулирующие эмбриональное развитие и рождение неонатов.

В.4.2.3 Культивирование Daphnia magna Straus для получения покоящихся (зимних) яиц

Экстремальные условия, стимулирующие половой способ размножения дафний, моделируют в лабораторных условиях на зимних яйцах. Эфиппиумы сохраняют и обеспечивают получение необходимого биологического материала к моменту проведения токсикологических опытов.

Для культивирования дафний с целью получения зимних яиц используют любые емкости подходящего объема в зависимости от количества требуемых для опыта эфиппиумов.

Культивирование и кормление дафний осуществляют таким же способом, как при выращивании лабораторной культуры. Получают зимние яйца из той же популяции дафний.

При хорошем кормлении плотность популяции в культурах постепенно увеличивается, достигая значения 1000 - 2000 .

Переход от бесполого к половому размножению обеспечивается двумя факторами: плотностью популяции (повышенная численность) и недостатком корма.

Точные значения этих двух факторов и длительность перехода от бесполого к половому размножению полностью зависят от специфических конкретных условий культивирования и определяются экспериментальным путем.

Начало полового размножения можно определить с помощью регулярных микроскопических наблюдений за культурами, в которых появятся самцы (они меньше самок), а также самки с эфиппиумами.

После того, как самки сбросили свои эфиппиумы, последние можно собрать на дне сосуда для культивирования.

Эфиппиумы следует хранить в холодильнике (при 4°С) в темноте в трубках с водопроводной или природной водой.

С учетом фазы покоя зимние яйца после вымета хранят в течение 3 мес, чтобы получить жизнеспособное потомство. Живые неонаты получают даже спустя 1 - 2 года при условии, что зимние яйца хранили при оптимальных условиях.

В.4.2.4 Выклев неонатов из эфиппиумов

Два основных фактора для запуска процесса эмбрионального развития оплодотворенных яиц - это свет и температура.

В лабораторных условиях продолжительность развития оплодотворенных яиц до появления неонатов составляет 72 ч.

Для получения неонатов эфиппиумы переносят в чашку Петри с той же культивационной средой, которая описана выше для культивирования дафний. Чашку Петри с тест-организмами инкубируют 72 ч при температуре (201)°С и интенсивности освещения примерно 6000 люкс.

В.4.2.5 Контроль качества

Неонаты дафний, вылупившиеся из зимних яиц, должны полностью соответствовать требованиям, которые предъявляют к тест-организмам, полученным из лабораторных культур.

Для контроля их соответствия указанным требованиям проверяют чувствительность неонатов, полученных из эфиппиумов, к бихромату калия, при этом значение 24 ч должно быть в диапазоне 0,6 - 2,1 .