Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению содержания патулина в фруктовых и овощных соках и пюре (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 30 декабря 1982 г. N 2655-82) (документ не действует)

Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению содержания патулина в фруктовых и овощных соках и пюре
(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 30 декабря 1982 г. N 2655-82)

Патулин - 4-окси-4Н-фуро-3,2-с пиран-2-(6Н)-он (эмпирическая формула ) - микотоксин, продуцируемый некоторыми видами микроскопических плесневых грибов рода Penicillium и Aspergillus. Наиболее распространенными продуцентами патулина являются грибы Penicillium expansum и Penicillium urticae. В естественных условиях патулин обнаружен в яблоках, грушах, айве, абрикосах, персиках, клубнике, помидорах, огурцах, а также в фруктовых и овощных соках и пюре.

Патулин обладает выраженными токсическими, мутагенными, тератогенными, а также канцерогенными свойствами. В соответствии с рекомендациями международных организаций ВОЗ/ФАО/ЮНЕП, он отнесен к потенциально опасным загрязнителям пищевых продуктов и его содержание в фруктовых и овощных соках и пюре не должно превышать концентрации 50 мкг/л. В продуктах детского питания содержание патулина не должно превышать концентрации 10-20 мкг/л (предел обнаружения метода).

На основе предлагаемого метода определения патулина лежит визуальная оценка интенсивности флуоресценции пятен патулина с исследуемого образца в присутствии стандартов патулина при двумерной тонкослойной хроматографии (ТОХ) после обработки хлором и раствором бензидина. Продолжительность анализа - ... часов; предел обнаружения патулина в соках - 10 мкг/л, в пюре - 20 мкг/л; относительное стандартное отклонение - 0,4-0,6.

Метод включает следующие этапы:

- очистку патулина от высокомолекулярных и нерастворимых компонентов образца о помощью диализа против 10%-ного водного раствора хлористого натрия в присутствии аскорбиновой кислоты, которая, в процессе диализа и экстракции этилацетатом диализата, предотвращает образование мешающих дальнейшему определению патулина примесей в экстракте;

- переэкстракцию патулина из водного раствора в этилацетат с последующей адсорбцией экстракта на силикагеле, совмещенной со стадией отгонки растворителя из этилацетатного экстракта, что снижает потери и улучшает дальнейшую очистку патулина от примесей;

- очистку патулиновой фракции с помощью колоночной хроматографии на силикагеле;

- обнаружение, идентификацию и определение содержания патулина с помощью двумерной ТСХ, которая в предлагаемых системах позволяет полностью отделить патулин от мешающих веществ, близких к нему по хроматографическим и флуоресцентным свойствам.

Оборудование и материалы

1. Аппарат для встряхивания проб по ТУ 64-1-2451-78 типа АВУ-6С.

2. Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор").

3. Насос водоструйный по ГОСТ 10696-75.

4. Весы технические по ГОСТ 19491-74.

5. Баня водяная с электронагревателем.

6. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) МРТУ 64-1-1080-63 или диагностическая лампа ОЛД-41.

7. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры.

8. Камеры для ТСХ с притертыми крышками, например, стеклянные четырехугольные сосуды 195x195x200 мм завода "Дружная горка".

9. Пластины для ТСХ "Силуфол" размером 15x15 см, ЧССР.

10. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц 100-250 микрон (силикагель Л), ЧССР.

11. Распылитель стеклянный с грушей.

12. Пленка целлофановая по ГОСТ 7730-74 (без нитроцеллюлозного покрытия).

13. Цилиндры мерные на 50 и 100 мл с притертой пробкой.

14. Колбы плоскодонные конические на 250 и 500 мл с НШ 29.

15. Колбы круглодонные на 500 мл с НШ 29.

16. Колбы грушевидные с НШ 14,5 на 50-60 мл (см. рис. 1).

17. Колбы мерные на 100 мл по ГОСТ 1770-74.

18. Колонка стеклянная хроматографическая 300x15 мм.

19. Патулин кристаллический.

20. Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) по МРТУ 6-06-6515-70.

21. Толуол по ГОСТ 5789-69.

22. Гексан по ТУ 6-09-3375-78.

23. Хлороформ медицинский или по ГОСТ 3160-51 "ХЧ".

24. Ацетон по ГОСТ 2603-71.

25. Бензол по ГОСТ 5955-75.

26. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74.

27. Кислота муравьиная по ГОСТ 5948-60.

28. Кислота соляная по ГОСТ 3118-67.

29. Бензидиновый раствор для опрыскивания ТСХ - пластинок, готовится растворением 1 г бензидина (производства ВНР, завод "Реанал") в смеси 200 мл 85%-ной муравьиной кислоты и 0,95 мл концентрированной соляной кислоты.

30. Калий марганцевокислый по ГОСТ 20490-75.

31. Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76 , прокаленный.

32. Натрий хлористый по ГОСТ 4233-66.

33. Аскорбиновая кислота

1. Подготовка пробы для анализа

При отборе проб для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТ 8756.0-70 "Пищевые продукты консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию" и ГОСТ 12430-66 "Сельскохозяйственная продукция. Методы отбора образцов при карантинном досмотре и экспертизе". При анализе соков и пюре размер среднего образца, из которого отбирается проба для анализа, не должен быть менее 1 литра. Отбор пробы проводят из свежевскрытых банок, перед отбором пробы сок или пюре тщательно перемешивают до получения однородной массы. В случае необходимости анализа фруктов или овощей из них следует получить сок с помощью соковыжималки любого типа с тем, чтобы объем среднего образца сока был не менее 1 литра.

2. Предварительная очистка пробы (диализ) и экстракция

К 20 мл сока добавляют 20 мг аскорбиновой кислоты (к 10 мл пюре добавляют 10 мл дистиллированной воды и 20 мг аскорбиновой кислоты), выливают в целлофановый мешочек для диализа, приготовленный из листа целлофана размером 30x30 см. Закрепляют мешочек в плоскодонной конической колбе на 250 мл с НШ 29 (или на 500 мл с НШ 29), в которую предварительно добавляют 200 мл 10%-ного раствора хлористого натрия в воде. Колбу встряхивают в течение 4 часов в аппарате для встряхивания проб. Мешочек извлекают из колбы, водный раствор из колбы переносят в делительную воронку на 500 мл, добавляют 100 мл этилацетата. Встряхивают, после разделения слоев верхний этилацетатный раствор отделяют. Нижний водный слой экстрагируют и делительной воронке этилацетатом (3x50 мл). Соединенные этилацетатные экстракты сушат сернокислым натрием (10-15 г) в течение 1 часа. Сухой этилацетатный раствор фильтруют через химическую воронку с кусочком ваты в круглодонную колбу на 500 мл с НШ 29. Сернокислый натрий промывают 20-25 мл этилацетата в отфильтровывают этилацетат в ту же круглодонную колбу. Добавляют 1 г (2 мл) силикагеля и упаривают досуха (до консистенций пересыпающегося сухого порошка силикагеля) на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40°.

3. Очистка экстракта с помощью колоночной хроматографии

На дно стеклянной колонки помещают кусочек ваты, наливают суспензию 2 г (4 мл) силикагеля в 20 мл толуола. Дают толуолу стечь, затем, не допуская просыхания колонки, добавляют 20 мл толуола и высыпают в колонку из круглодонной колбы силикагель с адсорбированным экстрактом. Дают толуолу стечь и элюируют колонку 100 мл толуола, толуольные элюаты отбрасывают. Круглодонную колбу споласкивают 5 мл смеси гексан-этилацетат (2:3) и выливают раствор в колонку, добавляют 100 мл смеси гексан-этилацетат (2:3), элюат отбирают в круглодонную колбу на 500 мл с НШ 29. Упаривают на ротационном испарителе до объема примерно 10 мл. Упаренный элюат количественно переносят в грушевидную колбу на 50-60 мл с НШ 14,5 и отростком (см. рис. 1). Круглодонную колбу споласкивают этилацетатом (2х5 мл) и добавляют этилацетат к экстракту в грушевидной колбе. Упаривают на ротационном испарителе до объема 0,2 мл (на цилиндрическом отростке должна быть проведена метка на уровне 0,2 мл, для чего колбу предварительно калибруют с помощью пипетки на 0,2 мл) при температуре бани не выше 40°. Полученный раствор анализируют с помощью двумерной ТСХ (раствор А).

ГАРАНТ:

Нумерация разделов приводится в соответствии с источником

3. Обнаружение и идентификация патулина

3.1. Приготовление стандартного раствора патулина.

Стандартный раствор патулина готовят следующим образом: навеску 1 мг кристаллического патулина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки смесью бензол-ацетонитрил (9:1). Концентрация патулина в стандартном растворе составляет 10 нг/мкл или 10 мкг/мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре не выше +5°. Срок годности стандартного раствора - до 6 месяцев.

3.2. Обнаружение патулина с помощью двумерной ТСХ.

Пластинку "Силуфол" размером 15х15 см размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 2а. В правом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят с помощью микрошприца или стеклянного калиброванного капилляра 20 мкл раствора А. В правом верхнем и левом нижнем углах на расстоянии 1,5 см от краев пластинки наносят по 4 мкл стандартного раствора патулина. Пластинку помещают в камеру для ТСХ, в которую предварительно наливают смесь хлороформ-ацетон-85%-ная муравьиная кислота (80:15:5), уровень растворителя должен быть примерно на 1 см ниже нанесенных пятен. Развитие хроматограммы проводят в первом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки, затем пластинку извлекают из камеры и сушат 5 минут на воздухе. Высушенную пластинку поворачивают на 90° по часовой стрелке и помещают в камеру для ТСХ со смесью толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота (50:40:10) Проводят развитие пластинки по# 2-ом направлении до достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 3 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат до исчезновения запаха растворителей (можно в струе теплого воздуха). Для обнаружения пятен патулина пластинку помещают в камеру с хлором на 15-20 минут. Атмосферу хлора в камере создают, помещая в камеру химический стакан или плоскодонную коническую колбу, в которой смешивают 60 мл 5%-ного водного раствора марганцевокислого калия и 50 мл 25%-ной соляной кислоты. Смешивание растворов марганцевокислого калия и соляной кислоты и помещение пластинки в камеру с хлором следует проводить в вытяжном шкафу, работая в резиновых перчатках. После извлечения пластинки из камеры с хлором её оставляют в вытяжном шкафу на 10-15 минут для полного удаления остатка хлора с пластинки. Затем пластинку опрыскивают 0,5%-ным раствором гидрохлорида бензидина в 85%-ной муравьиной кислоте. Примерно через 20 минут пластинку рассматривают в длинноволновом УФ-свете (лампа ОЛД-41 или прибор для флуоресцентного анализа витаминов, модель 833). Патулин проявляется в виде пятен с желтой флуоресценцией. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности пятнам стандартов патулина, свидетельствует о наличии патулина в анализируемом продукте.

4. Количественное определение патулина

Если в экстракте обнаружено наличие патулина, то необходимо провести количественное определение. Пластинку "Силуфол" размером 15х15 см размечают тонкими карандашными линиями согласно рис. 2б. В правом нижнем углу пластинки на расстоянии 1,5 см от краев наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора А. В правом верхнем углу на расстоянии 1,0 , 2,0 и 3,0 см от верхнего края пластинки и 1,5 см от правого края пластинки наносят соответственно 2,0, 4,0 и 6,0 мкл стандартного раствора патулина. В левом нижнем углу на расстоянии 1,5 см от краев наносят 3 мкл стандартного раствора патулина. Двумерную ТСХ и обнаружение патулина проводят аналогично пункту 3.2. Сравнивая интенсивность флуоресценции разных количеств стандарта патулина с интенсивностью флуоресценции пятна патулина в экстракте (растворе А), определяют количество нанограмм (нг) патулина в пятне экстракта.

Содержание патулина в соке (или в пюре) рассчитывают по формуле:

мкг/л, где

С - концентрация патулина в соке (пюре), в мкг/л;

- объем очищенного раствора экстракта в этилацетате перед ТСХ (раствор А), в мкл (200 мкл);

- объем раствора экстракта, наносимый на пластинку, в мкл (20 мкл);

V - объем сока (пюре), взятый для анализа, в мл (20 мл для сока, 10 мл для пюре);

m - количество патулина в пятне экстракта, в нг;

При приведенных в скобках объемах формула содержания патулина выражается следующим образом :

С = 0,5 m мкг/л (для сока) и

С = 1,0 m мкг/л (для пюре)

Если интенсивность флуоресценции патулина в пятне экстракта выше интенсивности флуоресценции пятна стандарта, соответствующего 6 мкл стандартного раствора (60 нг патулина), то на пластинку следует наносить меньший объем экстракта , например, 5 или 10 мкл. Если и в этом случае интенсивность флуоресценции пятна патулина в экстракте выше, чем у пятна, соответствующего 6 мкл стандартного раствора патулина, то следует разбавить раствор А этилацетатом, т.е. увеличить объем до 400 и более мкл.

Примечание:

В случае превышения ПДК патулина в фруктовых и овощных соках и пюре, но не более чем в два раза, эти продукты могут быть использованы в условиях максимального рассредоточения. Превышение ПДК патулина в продуктах детского питания не допускается. Вопросы об использовании продуктов с содержанием патулина, превышающим допустимые концентрации более, чем в два раза, в конкретных случаях должны решаться местными учреждениями санэпидслужбы.

В каждом случае превышения ПДК патулина в пищевых продуктах территориальная санэпидслужба обязана ставить перед учреждениями Минплодовощхоза СССР и другими ведомствами, ответственными зa производство пищевых продуктов, вопросы о необходимости выяснения причин этого обстоятельства, контроля за качеством исходного продовольственного сырья, условиями его транспортировки и хранения, разработки мероприятий по снижению их загрязненности патулином.

По вопросам практического внедрения метода обнаружения, идентификации и определения содержания патулина в пищевых продуктах следует обращаться в Институт питания АМН СССР (Москва, 109240, Устьинский проезд, 2/14; тел. 227-88-54).

________________________________          Заполненная карта направляется

(полное наименование организации,         по адресу: 109240, Москва,

    где заполняется карта)                Устьинский проезд 2/14 Институт

                                          питания АМН СССР

                                          Научно-организационный отдел

КАРТА ОБРАТНОЙ СВЯЗИ

К "Методическим рекомендациям по обнаружению, идентификации и определению содержания патулина в фруктовых и овощных соках и пюре"

1. Принято к внедрению в практику санэпидслужбы (где, когда) ____________

   ______________________________________________________________________

   ______________________________________________________________________

2. Полученный  положительный  эффект  (проведены  анализы  на  содержание

   патулина, получены конкретные данные) ________________________________

   ______________________________________________________________________

   ______________________________________________________________________

3. Материалы   не   могут   быть   использованы   по  следующим  причинам

   (указать причины) ____________________________________________________

   ______________________________________________________________________

   ______________________________________________________________________

4. Ваши замечания и пожелания ___________________________________________

   ______________________________________________________________________

   ______________________________________________________________________

   ______________________________________________________________________

           Подпись

           Должность