Приложение 7. Хранение культур бордетелл

Приложение 7

Хранение культур бордетелл

Работа с культурами для контроля качества среды

Коклюшная культура, высушенная из замороженного состояния под вакуумом, может храниться неопределенно долгое время при сохранении вакуума в ампуле и при температуре не выше 10°С. Ампулу с высушенным штаммом вскрывают стерильно над лотком. Верхний конец ампулы нагревают на пламени горелки и снимают парафин, затем кусочком стерильной ваты, смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу ампулы так, чтобы получилась небольшая трещина, и той же мокрой ватой обводят вокруг носика ампулы. После образования круговой (или неполностью круговой) трещины легким ударом пинцета удаляют конец ампулы. После вскрытия ампулы в нее стерильно наливают 0,2-0,3 мл стерильного физиологического раствора. После растворения сухого содержимого ампулы его переносят пастеровской пипеткой на чашку с питательной средой и 48-72 ч выращивают при температуре 35-37°C.

В первых пересевах микробы обладают несколько пониженной жизнеспособностью. Для восстановления полной жизнеспособности требуется 2-3 пассажа на оптимальных питательных средах. Рекомендуется для работы пользоваться культурой после второго или третьего пересева. В дальнейшем коклюшные культуры сохраняют на среде Борде-Жангу или КУА с 10% крови, пересевая 1 раз в 3-4 недели. Можно пользоваться культурой не более 10 пассажа.

Способы длительного хранения (без пересева)

1. Хранение культур коклюшного микроба в консервирующей смеси (рецепт МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского)

Готовят 2 раствора: 1 - 80%-й раствор глицерина в буферном физиологическом растворе; 2 - сахарозо-желатиновая среда (10%-й раствор сахарозы и 1%-й раствор желатина). Смешивают по 2 мл первого и второго растворов в стерильных агглютинационных пробирках, помещают на дно пробирки 3-4 петли 3-суточной культуры коклюшного микроба и хранят в морозильной камере холодильника или в глубоко морозильной камере при -30°C под ватно-марлевой пробкой до 1 года. При высевах берут петлей часть материала со дна пробирки и высевают на среду КУА с 3-4% крови, растирая шпателем.

Приготовление 80%-го раствора глицерина в буферном физиологическом растворе:

1) приготовление буферного физиологического раствора pH 7,2 (на 8 л):

NaCl - 69 г 200 мг, - 15 г 360 мг, - 3 г 520 мг растворяют в 8 л дистиллированной воды, автоклавируют при 0,3 атм в течение 30 мин;

2) 80%-й раствор глицерина стерилизуют в автоклаве при 1,8 атм в течение 30 мин.

Приготовление сахарозо-желатиновой среды:

На водяной бане при 55°C растворить в 300 мл дистиллированной воды 10 г желатина; растворить в 300 мл дистиллированной воды 100 г сахарозы; соединить 1 и 2 растворы, довести дистиллированной водой до 1 л, установить pH 7,0 раствором бикарбоната натрия, стерилизовать текучим паром в автоклаве три дня по 1 ч. Хранить разлитым во флаконы.

2. Хранение культур коклюшного микроба в полужидком КУА (с кровью и без крови), метод предложен ЦГиЭ г. Москвы

Казеиново-угольный агар готовится по прописи, но агар-агара добавляют 1 г на 1 л среды (0,1%), разливают по пробиркам (в количестве до 8 мл) и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. В полужидкий агар КУА можно добавить стерильную дефибринированную кровь крупного рогатого скота, лошади из расчета 0,5-1 мл на 8 мл среды. Культуру коклюшного микроба засевают в среду, выдерживают в термостате 3-4 дня, а затем без пересева сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре в течение 1 мес. При хранении культуры коклюшного микроба на плотной среде КУА ее пересевают через 10-14 дней.