Приложение 3. Приготовление питательных сред с добавками

Приложение 3

Приготовление питательных сред с добавками

В качестве питательной среды для посева исследуемого материала применяют картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу) и казеиново-угольный агар (КУА). Среды могут быть приобретены и приготовлены согласно инструкции производителя. Для улучшения роста при необходимости в среду можно добавить до автоклавирования активированный уголь (0,5%) и дрожжевой диализат или экстракт (50 мл на 1 л среды), предварительно нейтрализованный до pH 7,0 (по бромтимоловому синему до зеленого цвета), а также пролин или глютамин (0,03 г на 1 л среды).

Ростовые добавки вносятся в стерилизованную и остуженную до температуры 50°С среду. Оптимально добавлять в среды дефибринированную лошадиную или баранью кровь: в среду Борде-Жангу - 20%, в КУА - 10%. Добавление человеческой крови или эритроцитарной массы дает худшие результаты, их можно частично (5%) заменить сывороткой крупного рогатого скота (можно также добавить 1% питательной среды N 199).

Для подавления посторонней микрофлоры при посеве исследуемого материала используют пенициллин или бициллин. Их применяют как при обработке поверхности питательной среды, разлитой в чашки Петри, так и при внесении антибиотика в среду. В мировой практике для этих целей используется цефалексин, который, в отличие от пенициллина, не подавляет рост B. pertussis и более эффективен в отношении сопутствующей флоры.

Пенициллин

Для обработки поверхности среды используют антибиотик из расчета 7,5 МЕ, нанося его на поверхность среды шпателем или внося его в КУА, растопленный и остуженный до температуры 50°С, из расчета 30 МЕ на 100 мл среды.

Пенициллин разводят непосредственно перед взятием материала. Для этого во флакон с антибиотиком добавляют стерильный физиологический раствор для получения основного разведения пенициллина. При содержании во флаконе 500 000 МЕ в него добавляют 1 мл физиологического раствора, а при содержании 1 млн МЕ - 2 мл. Полученное основное разведение антибиотика во флаконе можно хранить в условиях холодильника при 4°C не более недели. Для получения необходимых для работы концентраций антибиотика 0,1 мл основного разведения из флакона (50 000 МЕ) растворяют в 9,9 мл стерильного физиологического раствора; 1 мл такого раствора содержит 5 000 МЕ на 1 мл. Далее делают разведения до получения 75 МЕ в 1 мл физиологического раствора.

Схема разведения пенициллина или бициллина:

1 пробирка - физиологический раствор 9,9 мл + 0,1 мл основного разведения антибиотика = в 1 мл 5 000 МЕ;

2 пробирка - физиологический раствор 8,5 мл + 1,5 мл раствора из 1 пробирки = в 1 мл 750 МЕ;

3 пробирка - физиологический раствор 4,5 мл + 0,5 мл раствора из 2 пробирки = в 1 мл 75 МЕ.

Из третьей пробирки наносят 0,1 мл (7,5 МЕ) на поверхность питательной среды в каждой чашке, тщательно втирая шпателем.

Раствор из третьей пробирки можно использовать для внесения его внутрь среды. Для этого 4 мл (300 МЕ) антибиотика добавляют на 1 л среды (из расчета 30 МЕ на 100 мл среды). Это же разведение можно использовать для добавления к смачивающим жидкостям из расчета 0,1 мл на 10-12 мл жидкости. Рабочее разведение антибиотика (в последней пробирке) используют только в день приготовления.

Цефалексин используется в концентрации 40 мг/л среды. Он производится как селективная добавка для бордетелл (Bordetella selective supplement). Содержимое одного флакона (20 мг цефалексина) асептически растворяется в 2 мл стерильной дистиллированной воды и добавляется к 500 мл стерильной остуженной до температуры 50°С питательной среды.