Приложение. Приготовление материалов для исследований

Приложение
к Методическим указаниям по
контролю качества дезинфекции
объектов, подлежащих
ветеринарному надзору.

1. Приготовление нейтрализующих растворов.

Нейтрализующие растворы готовят в концентрации в 10 раз меньшей чем концентрация использованного дезинфицирующего средства.

Раствор готовят на стерильной воде в стерильной посуде и разливают в пробирки или флаконы с соблюдением правил стерильности. (Растворы уксусной кислоты и бикарбоната натрия можно стерилизовать автоклавированием). Раствор аммиака стерилизации не подлежит. Готовые пробирки (флаконы) можно хранить в течение 5 дн при комнатной температуре.

2. Приготовление тампонов.

Ватные или марлевые тампоны для взятия смывов монтируют на алюминевой проволоке, пропущенной через резиновую пробку. В пробирки разливают по 10 мл физиологического раствора, закрывают резиновыми пробками с вмонтированными тампонами и стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин.

3. Подготовка материалов для исследования методом отпечатков.

3.1. Подготовка предметных стекол. Для исследования используют предметные стекла (размером 2,5 х 7,5 см) или стекла, разрезанные вдоль на две половинки (1,2 х 7,5 см). Стекла предварительно кипятят 10-15 мин в 2-5%-ном растворе моющего порошка типа "Лотос" "Новость" и т.п., затем поверхность предметных стекол с двух сторон натирают с помощью зубной щетки или ерша этим же порошком, слегка увлажненным водой после чего тщательно промывают в проточной воде, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Подготовленные стекла хранят в банке с притертой крышкой в сухом виде.

3.2. Обработка ванн и пробирок, предназначенных для транспортировки, хранения и инкубирования проб-отпечатков. При взятии проб на широкие стекла используют пластмассовые ванны для окраски мазков крови на предметном стекле (ТУ-64-1), на узкие - бактериологические пробирки, закрытые резиновыми пробками.

Пластмассовые ванны разбирают и тщательно моют горячим мыльным раствором, после чего ополаскивают вначале водопроводной водой, затем 65-70%-ным этиловым спиртом или кипящей дистиллированной водой и облучают в течение 2 ч ультрафиолетовыми лучами. На дно обработанной указанным способом ванны помещают стерильную фильтровальную бумагу, затем ванны собирают и закрывают крышками.

Бактериологические пробирки и резиновые пробки моют и стерилизуют общепринятым способом. Перед стерилизацией на дно пробирки помещают небольшой ватный тампон.

3.3. Подготовка предметных стекол со средой. В стерильном боксе на предметные стекла наносят тонкий слой расплавленной питательной среды: для выделения группы бактерий кишечной палочки используют агар Эндо, стафилококков - 8,5%-ный солевой мясо-пептонный агар (рН 7,2-7,4). Количество нанесенной среды должно соответствовать 0,15 мл (4 капли) для узкого предметного стекла и 0,33 мл (8 капель) для широкого.

Перед нанесением на стекло среду, находящуюся в пробирках, ставят в водяную баню и расплавляют. В расплавленную среду погружают стерильную пастеровскую пипетку. Температуру воды в бане поддерживают в пределах 80-90°С.

Прогретые над пламенем горелки предметные стекла раскладывают на ровной, строго горизонтальной поверхности стола. Предметные стекла берут корцангом, слегка подогревают и наносят пипеткой указанное количество питательной среды, отступя на 2-2,5 см от поперечного края стекла. Затем, расположив горизонтально пастеровскую пипетку, питательную среду быстро распределяют по средней трети поверхности стекла. Распределив среду, стекла раскладывают на строго горизонтальную поверхность стола и подсушивают при комнатной температуре до появления вокруг питательной среды высушенной полосы шириной 0,5-1 мм. Широкие стекла со средой помещают в пластмассовые ванны, узкие - в пробирки.

Ванны и пробирки предварительно увлажняют, внеся на дно 1 или 0,1 мл стерильной водопроводной воды соответственно.

Для удобства транспортировки ванны устанавливают в биксы, пробирки - в металлические пеналы или в специально приспособленную сумку.

Подготовленные предметные стекла с солевым агаром хранятся при температуре +4°С до 10 сут, со средой Эндо - 2-3 сут (если нет видимого изменения цвета среды).

4. Подготовка стекол для микрокультивирования микобактерий.

Предметные стекла разрезают вдоль на узкие стекла размером 1,2 х 7,5 см, моют и помещают на 2 ч в хромпик, который готовят следующим образом: берут двухромовокислый калий (40 г) помещают в фарфоровую кружку или эксикатор и растворяют в небольшом количестве воды, затем добавляют осторожно концентрированную серную кислоту до общего объема 1 л.

После хромпика стекла вновь моют дистиллированной водой, протирают чистой льняной тканью, стерилизуют сухим жаром (160°) в течение 2 ч и хранят в закрытых сосудах (эксикаторах).

5. Приготовление питательных сред.

5.1. Среды для выделения кишечной палочки.

5.1.1. Модифицированная среда Хейфеца.

К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 4 г лактозы. Смесь доводят до кипения, затем фильтруют и после остывания определяют рН, который должен быть в пределах 7,4-7,8. Затем к среде добавляют в качестве индикатора 1 мл 5%-ного водного раствора метиленовой сини. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 15 мин. Исходный цвет среды - красновато-сиреневый.

5.1.2. Питательная среда КОДА сухая. Состав и способ приготовления приведены в этикетке на упаковке среды.

5.2. Среды для выделения стафилококка.

5.2.1. Солевой мясо-пептонный бульон. К обычному МПБ с рН 7,2-7,4 добавляют 6,0% натрия хлорида квалификации "ХЧ" или "ЧДА", перемешивают до полного растворения соли, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм в течение 20-30 мин.

5.2.2. Солевой мясо-пептонный агар. К расплавленному МПА добавляют 8,0% натрия хлорида квалификации "ХЧ" или "ЧДА", перемешивают до полного растворения соли, разливают в колбы и стерилизуют при 1 атм 20-30 мин. Перед использованием солевой агар разливают в стерильные бактериологические чашки по 10-15 см. После застывания среды ее подсушивают в термостате в течение 1 ч.

5.3. Дифференциально-диагностическая среда для индикации Вас. anthracis

5.3.1. Приготовление растворов ингредиентов.

Полимиксина М сульфат во флаконе растворяют в стерильной дистиллированной воде, а затем последовательными разведениями стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида доводят до концентрации 10000 ЕД/мл.

Невиграмон переносят в стеклянный флакон или пробирку и растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака при тщательном перемешивании стеклянной палочкой. Затем последовательно разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл.

Моющее средство "Прогресс" разводят стерильной дистиллированной водой до 0,1%-ной концентрации.

Гризеофульвин в таблетках тщательно растирают в ступке, затем растворяют в стерильной дистиллированной воде до содержания 100 мкг препарата в 1 мл.

Фенолфталеинфосфат натрия (продажный 10%-ный раствор) для стерилизации прогревают на водяной бане при 56°С в течение 30 мин.

5.3.2. Приготовление дифференциально-диагностической среды.

Питательный агар в колбах по 100 мл расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до температуры 45-50°С. Затем в агар добавляют основные растворы:

	полимиксина М сульфата	- 0,5 мл
	невиграмона	- 0,5 мл
	гризеофульвина	- 1,0 мл
	моющего средства "Прогресс"	- 1,0 мл
	фенолфталеинфосфата натрия	- 0,1 мл

Примечание: гризеофульвин добавляют в среду при подозрении на загрязнение материала грибами.

После перемешивания среду разливают в чашки Петри и подсушивают в течение 1,5-2 ч с открытыми крышками. Дифференциально-диагностическую среду после разлива можно хранить в холодильнике в течение 1-2 сут.

5.3.3. Готовую дифференциально-диагностическую среду выпускает Ставропольский НИИВС (355100, г. Ставрополь, ул. Биологическая, 20).

5.4. Среды для выделения микобактерий.

5.4.1. Среда Сотона.

В 940 мл дистиллированной воды растворяют 4 г аспарагина (-аспаргин ) , 2 г лимонной кислоты, 0,5 г калия фосфорнокислого двухзамещенного, 0,5 г сернокислой магнезии, 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа, а затем добавляют 60 мл нейтрального глицерина. После полного растворения аспарагина и солей рН среды должен соответствовать показателю 7,4. Среду разливают по 200 мл в колбы емкостью 250 мл и стерилизуют 30 мин в автоклаве при 1,5 атм.

Перед использованием в колбу со средой Сотона добавляют 30 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота и разливают в стерильные пробирки по 7-8 мл.

5.4.2. Среда Петраньяни. Ингредиенты: Молоко цельное 300 мл, крахмал картофельный 12 г, пептон 2 г, картофель очищенный, мелко нарезанный, 2 клубня размером с яйцо.

Указанные ингредиенты тщательно смешивают в колбе, смесь несколько минут кипятят на водяной бане,. После этого колбу оставляют на водяной бане еще на 1 час. К охлажденной до 50 градусов смеси добавляют 8 цельных яиц и 2 желтка, 24 мл глицерина, 20 мл 2%-ного стерильного водного раствора малахитовой зелени, хорошо перемешивают, фильтруют через воронку с двойным слоем марли, разливают по пробиркам и стерилизуют, как указано ниже.

5.4.3. Среда Гельберга - ингредиенты: яйца цельные 6 шт., желтки 4 шт., молоко 100 мл, картофельный отвар 100 мл, солевой раствор 100 мл, 2%-ный водный раствор малахитовой зелени 7,5 мл.

Молоко, картофельный отвар и солевой раствор готовят заранее и хранят в холодильнике.

Молоко предварительно ставят на одни сутки в холодильник, снимают сливки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в бутылочки по 110 мл и стерилизуют текучим паром в аппарате Коха два дня подряд: в первый день - 15 мин., во второй - 10 мин. (после стерилизации во флаконе остается 100 мл молока).

Для приготовления картофельного отвара картофель моют щеткой с мылом, чистят, заливают двойным количеством водопроводной воды (на 1 кг картофеля берут 2 л воды), кипятят 15 мин, отстаивают и верхний слой фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Отвар разливают во флаконы по 110 мл, стерилизуют в автоклаве, при этом температуру доводят до 120°С, после чего автоклав отключают.

Для приготовления солевого раствора берут 1 г двузамещенного фосфорно-кислого калия (), 1 г лимоннокислого натрия, 1 г сернокислого магния, 6 г пептона, 30 мл глицерина химически чистого, воды дистиллированной до 1000 мл.

Соли растворяют в небольшом количестве воды добавляют глицерин и остальную воду. Раствор слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 110 мл и стерилизуют в автоклаве так же, как и картофельный отвар.

Приготовление среды в банку с бусами и взбитыми яйцами добавляют по 100 мл молока, картофельного отвара, солевого раствора и 7,5 мл 2%-ного водного раствора малахитовой зелени, смесь тщательно размешивают, разливают по пробиркам и стерилизуют, как указано ниже.

5.4.4. Среда Левенштейна-Йенсена - ингредиенты:

	Однозамещенный фосфорнокислый калий ()	- 2,4 г
	Сернокислый магний ()	- 0,24 г
	Лимоннокислый магний	- 0,6 г
	Аспарагин ()	- 3,6 г
	Глицерин химически чистый ()	- 3,6 г
	Вода дистиллированная	- до 600 м.

Соли растворяют в указанной последовательности, раствор стерилизуют 2 ч. текучим паром.

Питательную среду готовят следующим путем: в колбу, содержащую 30 г картофельной муки, постепенно добавляют 600 мл солевого раствора, смесь нагревают, постоянно взбалтывая, на кипящей бане до вязкой консистенции. Затем к охлажденной смеси добавляют 1 л профильтрованной через марлю яичной массы, хорошо смешивают и доливают 20 мл стерильного 2%-ного водного раствора малахитовой зелени. Смесь тщательно встряхивают и разливают по пробиркам (рН готовой среды 6,8-7,0).

Все яичные среды, приготовленные по указанным прописям, разливают в пробирки по 4-5 мл, помещают для свертывания в аппарат Коха в наклонном положении и стерилизуют в течение двух суток при 85°С по 40 мин в сутки или один раз при 90°С в течение 1 часа.

После стерилизации на дне пробирки должно остаться небольшое количество конденсационной жидкости. В случае ее отсутствия добавляют в каждую пробирку перед стерилизацией (при двукратной стерилизации - перед второй стерилизацией) по 0,5-1,0 мл физиологического раствора.

Для контроля стерильности яичные среды помещают в термостат на сутки. При посевах и пересевах материала и культур рекомендуется применять свежие среды. Среды хранят в сухом прохладном месте не более двух недель.

6. Приготовление индикаторных пробирок для контроля качества дезинфекции аэрозолями формальдегида.

6.1. Индикаторные пробирки представляют собой стеклянные трубки диаметром 4-8 мм и длиной 40-50 мм. В качестве таких пробирок могут быть использованы пробирки Уленгута или отрезки пастеровских пипеток, запаянные с одного конца. Пробирки заливают расплавленной индикаторной средой до уровня обреза пробирок, запечатывают парафином и хранят при температуре 0-5°С. Срок хранения - 1 месяц со дня изготовления.

На индикаторные пробирки при их изготовлении можно нанести две риски на расстоянии 18 и 30 мм от среза пробирки - тогда надобность в использовании линейки при учете результатов отпадает.

6.2. Для экспресс-метода контроля качества аэрозольной дезинфекции помещений используют среду Эндо, выпускаемую биопромышленностыо в сухом виде. 2%-ную взвесь сухой среды в дистиллированной воде доводят до кипения и фильтруют через ватный фильтр, после чего среду заливают в пробирки с помощью пипеток.

7. Подготовка тест-объектов.

7.1. В качестве тест-культур используют музейные штаммы кишечной палочки, золотистого стафилококка (Staureus шт. 209-Р) и антракоида (Вас. anthracoides шт. 96).

Музейные культуры хранят при температуре -4°С в виде сухой культуры в ампулах (после лиофильной сушки) не более двух лет; в виде посевов на МПА (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5-3 мм) не более шести месяцев.

7.2. Подготовка тест-объектов для контроля качества дезинфекции спецодежды. Батистовую ткань стирают, гладят и нарезают на кусочки размером 5х10 мм, раскладывают их по 50 шт в чашки Петри. Чашки завертывают в плотную бумагу и стерилизуют в автоклаве при температуре 110°С (0,5 атм), в течение 30 мин.

Стерильные тест-объекты в той же чашке Петри заливают смесью 2-миллиардной взвеси тест-культуры и инактивированной сыворотки крови (или 40-50-ной эмульсии кала животных), взятых в соотношении 1:1, из расчета 1 мл на 1 тест-объект. Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 20 мин, после чего тест-объекты переносят в другую чашку Петри на поверхность стерильной фильтровальной бумаги, положенной на дно чашки в 2 слоя, покрывают сверху листом стерильной фильтровальной бумаги, чашку закрывают крышкой. Через 10 мин тест-объекты переносят на поверхность листа стерильной фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37°С в течение 20-30 мин.