Методические указания по определению в зерне и продуктах его переработки фосфорорганических пестицидов, применяемых для обеззараживания зерна и зернохранилищ, хроматографическими методами (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 22 октября 1981 г. N 2469-81)

1. Характеристика анализируемых пестицидов.

Характеристика фосфорорганических пестицидов (ФОП), применяемых для обеззараживания зерна и зернохранилищ, и гигиенические регламенты приведены в таблице 1.1.

2. Методика определения в зерне и продуктах его переработки фосфорорганических пестицидов, применяемых для обеззараживания зерна и зернохранилищ, хроматографическими методами.

2.1. Основные положения.

2.1.1. Принцип метода.

В основу методики положен систематический ход анализа ФОП (карбофоса, хлорофоса, ДДВФ, фоксимы метилнитрофоса) в зерне и зернопродуктах хроматографическими методами после экстракции пестицидов из проб ацетоном.

Систематический ход анализа слагается из нескольких этапов:

а) определение пестицидов в экстракте, без его очистки, хроматоэнзимным методом с использованием единой подвижной фазы - хлороформа (исключение для хлорофоса) - и различных условий активации соединений на пластинках, приведенных в таблице 2.1.1.;

б) подтверждение предварительно установленного пестицида методом газожидкостной (ГЖХ) или тонкослойной (ТСХ) хроматографии с применением условий хроматографирования, специфических для этого соединения.

Схема проведения систематического хода анализа приведена на рис. 2.1.1. Проведение систематического хода анализа позволяет надежно идентифицировать ФОП, рекомендованные в настоящее время для обеззараживания зерна и зернохранилищ, #.

ГАРАНТ:

Здесь и далее нумерация приводится в соответствии с источником

Таблица 1.1

Характеристика анализируемых пестицидов

N	Пестицид	Структурная формула	Мол. масса	Тпл., °С	, °С	Растворимость г/100 г		для крыс	ДОК, шт./кг
						в воде	в орг. раств.		зерно	мука	хлеб
1.	Карбофос		330,4	2,3-3,7	156 (0,7)	0,015	ац., сп. ДХЭ, мет.	1375	3,0	1,0
2.	Фоксим		298,3	3-4	102 (0,01)	т.р.	хлф., ац., сп.	1900-2060	0,6*
3.	Хлорофос		257,4	83-84	120 (0,4)	15,4	бзл. ац., хлф.	630	-
4.	ДДВФ		220,9	-	120 (0,14)	1	ац., бзл. ДХЭ, мет.	80	0,3	не допускается
5.	Метилнитрофос (МНФ)		277,2	-	164 (1,0)	т.р.	ац., бзл. хлф., сп.	242-433	1*	0,3*	0,1*
Метаболиты МНФ:			261,2				ац., сп.
6.	Фенитрооксон
7.	п-Нитрокрезол		153,1	129	-	т.р.	ац., сп.

______________________________

* Приведены ДОК, рекомендованные к утверждению.

Таблица 2.1.1

Способы активации и величины исследуемых ФОП

Пестицид	Способ активации*		Нижний предел обнаружения**, мкг	в хлороформе	в бинарной ПФ
					ПФ
Хлорофос	активация аммиаком (1)	0,01		0,0	н-гексан:ацетон 1:1	0,34
ДДВФ	без активации (2)	0,01		0,10	н-гексан:ацетон 1:1	0,56
Фенитрооксон	-"-	0,001		0,72	н-гексан:ацетон 4:1	0,24
Карбофос	активация бромом (3)	0,001		0,46	-	-
Метилнитрофос	-"-	0,001		0,91	н-гексан:ацетон 4:1	0,41
Фоксим	-"-	0,001		0,85	н-гексан:ацетон 9:1	0,43

______________________________

* в скобках указан порядковый номер активации, упоминаемый при дальнейших объяснениях хода анализа.

** в качестве проявляющего реагента использован раствор индоксил-ацетата

2.1.2. Метрологическая характеристика хромато-энзимного и газохроматографического методов.

Диапазон определяемых концентраций 0,001-10 мкг

Предел обнаружения 0,001 мкг (0,02 мг/кг)

Размах варьирования 75-105%

Среднее значение определения стандартных количеств исследуемых пестицидов (хромато-энзимным методом) - 87%, (методом ГЖХ) - 81%

Доверительный интервал среднего при р = 0,95 и n = 5 (для хромато-энзимного метода) , (для метода ТСХ) .

2.1.3. При предварительной идентификации хромато-энзимным методом определению карбофоса, фоксима к метилнитрофоса могут мешать Р = S фосфорорганические пестициды, имеющие близкие к ним значения - фозалон, цидиал, фталофос, фенкаптон, метафос. Однако последние не применяются для обеззараживания зерна и зернохранилищ.

2.2 Реактивы и растворы

Основные стандартные растворы пестицидов (А) - карбофоса, хлорофоса, ДДВФ, фоксима, метилнитрофоса, фенитрооксона - в ацетоне, содержащие действующего вещества 100 мкг/мл

Рабочие стандартные растворы готовят разбавлением основного раствора "А":

Раствор "Б" - 0,5 мл раствора "А" доводят в мерной колбе до 100 мл ацетоном (содержание пестицида 0,5 мкг/мл)

Раствор "В" - 5 мл раствора "Б" доводят в мерной колбе до 25 мл (содержание пестицида 0,1 мкг/мл).

2.2.1. Для экстракции

Ацетон х.ч. ГОСТ 2603-79

н-Гексан х.ч. ТУ 6-09-3375-78

Диэтиловый эфир (для наркоза) Госфармакопея СССР

Натрий сернокислый безводный ГОСТ 4166-76

Хлороформ х.ч. ГОСТ 20015-74

Спирт этиловый, 96%, ТУ 6-09-17-10-77

Фильтры бумажные (красная лента)

2.2.2. Для хромато-энзимного определения (ТСХЭ)

Силикагель КСК, раздробленный и просеянный через сито 100 меш

Кальций сернокислый ГОСТ 3210-77, прокаленный в течение 6 часов при 160°С.

Бром ч. ГОСТ 4109-74

Индоксилацетат ч.д.а. ТУ 6-09-07 ..[ ] 56-78 или фирмы (Чехословакия)

Калий железосинеродистый х.ч. ГОСТ 4206-75 - 0,05 М водный раствор (1,645 г растворяют в 100 мл води)

Калий железистосинеродистый х.ч., ГОСТ 4207-65 - 0,05 М водный раствор (2,110 г растворяют в 100 мл воды).

Ортофосфорная кислота х.ч. ГОСТ 6552-80

Борная кислота х.ч. ГОСТ 9656-75

Уксусная кислота, ледяная х.ч. ГОСТ 18290-72

Едкий натр х.ч. ГОСТ 4328-77

Буферный раствор pH = 8,69: готовят раствор смеси ортофосфорной (2,1 мл), уксусной (2,3 мл), борной (2,47 г) кислот и доводят дистиллированной водой до 1 л. Для получения буферной смеси с рН = 8,69 к 100 мл указанного раствора прибавляют 65 мл 0,2 Н раствора едкого натра.

Ферментный препарат получают из печени крупного рогатого скота (свежую печень, однократно замороженную и сохраняемую в дальнейшем в холодильнике, можно использовать в течение 6 месяцев). Для приготовления ферментного раствора 1 г печени растирают в ступке с 9 мл буферного раствора и фильтруют через вату. К 1 мл полученной сыворотки прибавляют 4 мл буферного раствора и используют этот раствор для опрыскивания пластинок. Используют свежеприготовленный раствор.

Проявляющий реагент: 10 мг индоксилацетата растворяют в 6 мл этанола, прибавляют 6 мл дистиллированной воды, 1 мл раствора железосинеродистого и 1 мл железистосинеродистого калия и хорошо перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед опрыскиванием. На одну пластинку расходуется 3-4 мл смеси.

2.2.3 Для хроматографии в тонком слое (ТСХ)

Силикагель КСК, раздробленный и просеянный через сито 100 меш

Кальций сернокислый, подготовленный как показано в п. 2.2.2.

Крахмал водорастворимый ГОСТ 10163-76

Серебро азотнокислое ч.д.а. ГОСТ 1277-75

Бромфеноловый синий индикатор (водонерастворимый) ТУ 6-09-1058-76

5%-ный водный раствор уксусной кислоты 61-75

Резорцин ч.д.а. ГОСТ 9945-62

Натрий углекислый ч. ГОСТ 63-79

Цинковая пыль ГОСТ 989-62

п-Диметиламинобензальдегид ч.д.а. ТУ 6-09-3272-77

Проявляющие реагенты:

Бромфеноловый синий (БФС) используют для обнаружения карбофоса, фоксима, метилнитрофоса, 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят до 100 мл 0,5%-ным раствором азотнокислого серебра в смеси ацетона с водой 3:1. Через 10 мин после опрыскивания БФС пластинку опрыскивает 5%-ным раствором уксусной кислоты.

Щелочной раствор резорцина используют для обнаружения хлорофоса и ДДВФ. 2%-ный водный раствор резорцина перед опрыскиванием смешивают с 10%-ным водным раствором углекислого натрия в отношении 2:3.

Раствор п-диметиламинобензальдегида используют для обнаружения метилнитрофоса и фенитрооксона на пластинках с добавкой цинка, 0,25%-ный раствор п-диметиламинобензальдегида в этаноле. Раствор перед обработкой пластинок смешивают в соотношении 10:1 с ледяной уксусной кислотой.

2.2.4. Для газожидкостной хроматографии (ГЖХ)

Стационарная фаза - метилсиликоновый полимер SE-30 в количестве 5% на хроматоне N-AW-НМДС 0,16-0,20 мм и в количестве 3% на хроматоне N-AW-НМДС.

Водород ГОСТ 3022-70

Азот особой чистоты (содержание должно превышать 0,003%) ГОСТ 9293-74

Стекловата

2.3. Приборы и посуда

2.3.1. Для экстракции

Колбы конические плоскодонные на шлифах, емкостью 250, 100 мл - ГОСТ 10394-72

Воронки химические мм ГОСТ 8613-75

Цилиндры мерные на 100, 25, 10 мл ГОСТ 1770-74

Пробирки мерные на шлифах емкостью 5-10 мл ГОСТ 1770-74

Ротационный испаритель с набором колб ИР-IM ТУ-25-11-917-76

2.3.2. Для хроматографических определений

Хроматограф марки "Цвет" с термоионным детектором ТУ 1.500.033

Баллон для азота особой чистоты

Баллон для водорода

Компрессор для нагнетания воздуха

Колонки стеклянные, длина 1 м или 3,5 м, внутренний диаметр 3 мм

Микрошприц на IС мкл МШ-10 ТУ 5Е 2.833.024

Стеклянные пластинки размером 9x12 см

Камера для хроматографирования см, h = 20 см, ГОСТ 10565-75

Пульверизаторы стеклянные

Камера для опрыскивания (стеклянный колпак мм) - СТУЗО-6192-75

Пипетки на 1 мл, 5 мл, 10 мл ГОСТ 20292-74 2 КЛО

Мерные колбы емкостью 25, 100 мл ГОСТ 1770-74

Микропипетки на 0,1 мл с ценой деления 0,01 мл ГОСТ 1770-74

Термостат СШ-35

Ступка керамическая см

Эксикатор

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Отбор, хранение и доставка проб.

Отбор и хранение проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб ...", утвержденными заместителем Главного Государственного санитарного врача СССР А.И. Заиченко за N 2051-79 от 21 августа 1979 г.

2.4.2 Приготовление пластинок для ТСХЭ и ТСХ

2.4.2.1. Пластинки с гипсом

Для приготовления 12 пластинок берут 35 г силикагеля КСК, 2 г сернокислого кальция, приготовленного как описано в п. 2.2.3. и 90 мл дистиллированной воды. Силикагель с гипсом растирают в фарфоровой ступке, прибавляют воду и размешивают до образования однородной массы. 10 г суспензии наносят на пластинку и равномерно распределяют по поверхности. Сушат пластинки строго в горизонтальном положении в течение 18-20 часов при комнатной температуре, хранят в эксикаторе.

2.4.2.2. Пластинки с крахмалом.

Для приготовления 15 пластинок берут 40 г силикагеля КСК, 1 г крахмала и 125 мл дистиллированной воды. Крахмал заваривают в 20 мл воды, доливают остальную воду, засыпают силикагель и хорошо перемешивают. Далее поступают как описано в п. 2.4.2.1.

2.4.2.3. Пластинки с добавлением цинковой пыли.

Для приготовления 7 пластинок берут 14 г силикагеля КСК, 1,5 г сернокислого кальция, приготовленного как описано в п. 2.2.3., 1 просеянной цинковой пыли, смешивают в ступке, прибавляют 40 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и наносят на пластинки (~ по 6 мл).

2.5. Описание определения

2.5.1. Экстракция.

Из средней пробы зерна, муки, отрубей измельченного хлеба массой 1 кг для анализа методом квартования отбирают три навески по 25 г (зерно 50 г). Пробу заливают 50 мл ацетона и оставляют на час, периодически встряхивая. Сливают растворитель через фильтр, пробу заливают новой порцией ацетона и экстрагируют еще 1 час. Объединяют обе порции экстракта, сушат безводным сернокислым натрием в течение 15 мин и переносят в прибор для отгонки растворителей. Упаривают растворитель до объема ~ 1 мл под вакуумом на ротационном испарителе при температуре бани не более 45°С. Остаток из колбы переносят в мерную пробирку, фильтруя через бумажный фильтр, смоченный ацетоном. Ополаскивают колбу ацетоном, фильтруя смывы, доводят объем в пробирке до 5 мл. Проводят предварительную идентификацию хромато-энзимным методом.

2.5.2. Хромато-энзимное определение

Для хромато-энзимного определения используют пластинки, приготовленные как описано в п. 2.4.2.1. С целью уменьшения краевого эффекта с хроматографической пластинки снимают с краев вдоль направления движения подвижной фазы (со стороны 12 см) слой сорбента шириной 2-3 мм. Затем вдоль этой же стороны пластинку разделяют полосами на 4 равные части. Экстракт пробы в объемах 2 и 20-50 мкл (из общего объема 5 мл) наносят на 1-ю и 3-ю полосы трех пластинок. Затем в качестве стандарта на 2-ю и 4-ю полосы 1-й пластинки наносят хлорофос в количестве 0,01 и 0,05 мкг, на вторую пластинку - фенитрооксон в количестве 0,001-0,010 мкг, на третью - карбофос в количестве 0,001 и 0,010 мкг.

Пластинки с фенитрооксоном (пластинка N 2) и карбофосом (N 3) хроматографируют в хлороформе, а пластинку с хлорофосом (N 1) в смеси н-гексан-ацетон 1:1, т.к. хлорофоса в хлороформе 0 (см. таблицу 2.1.1.). Затем пластинку N 1 активируют аммиаком, N 2 не активируют и N 3 активируют бромом.

2.5.2.1. Активация аммиаком.

Пластинку N 1 после хроматографирования и удаления растворителя с пластинки опрыскивают разбавленным раствором аммиака (1 часть аммиака и 4 части воды) до слабого увлажнения слоя. Экспозиция 15 мин при комнатной температуре. Затем проводится ингибирование.

2.5.2.2. Активация бромом.

Пластинку N 3 после хроматографирования и удаления растворителя помещают на 1 минуту в эксикатор, насыщенный парами брома. После удаления избытка брома с пластинки (~ 60 мин) проводится ингибирование.

2.5.2.3. Ингибирование.

После активации 1-й и 3-й пластинок все три пластинки опрыскивают свежеприготовленным ферментным раствором и инкубируют в течение 40-60 мин в насыщенном водными парами термостате при температуре 38°С. Для увлажнения в термостат ставят чашку Петри с водой.

2.5.2.4. Проявление пластинок.

После инкубации пластинки опрыскивают раствором индоксил-ацетата, приготовленным как указано в п. 2.2.2. Пестициды проявляются в течение 10-30 мин в виде белых пятен на светло-синем фоне. Идентификацию соединений проводят в соответствии с данными, приведенными в таблице 2.1.1, ориентируясь на величины и способ активации.

2.5.2.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят путем сравнения площади пятна пробы с наиболее близкой к ней по величине площадью стандарта. Пропорциональная зависимость площади пятна от концентрации соблюдается для исследуемых пестицидов в пределах 0,001-0,100 мкг. Содержание пестицида в пробе рассчитывают по формуле:

, где

X - содержание пестицида в пробе, мг/кг

А - содержание пестицида в стандарте, мкг/мл

- объем стандарта, нанесенного на пластинку, мкл

- площадь пятна стандарта,

- площадь пятна пробы,

- объем экстракта, нанесенного на пластинку, мкл

V - общий объем экстракта, мл

Р - масса пробы, взятой для анализа, г.

Для подтверждения структуры соединения, установленного хромато-энзимным методом дальнейшее определение проводят в соответствии со схемой, приведенной на рис. 2.1.1., методом газожидкостной или тонкослойной хроматографии.

2.5.3. Газохроматографический анализ

Для подтверждения наличия в пробе фоксима и МНФ, характеризующихся близкими значениями и одинаковым способом активации (см. табл. 2.1.1.) используется метод ГЖХ.

В этом случае для анализа используется ацетоновый экстракт пробы (5 мл), полученный как описано в п. 2.5.1.

Определение проводится на хроматографе марки "Цвет" с термоионным детектором. Рабочая шкала электрометра , скорость протяжения ленты самописца 200 мм/час, скорость газа-носителя азота 22 мл/мин.

2.5.3.1. Условия хроматографирования

Определение МНФ.

Колонка стеклянная, длина 1 м, внутренний диаметр 3 мм.

Носитель хроматон N-AW-НМДС с 5% SЕ-30.

Температура колонки 190°C, испарителя 200°С.

При указанных условиях хроматографирования время удерживания МНФ 3,8 мин. Фоксим при этих условиях разрушается на колонке.

Определение фоксима.

Колонка стеклянная, длина 3,5 м, внутренний диаметр 3 мм.

Носитель хромотон N-AW-НМДС с 3% SЕ-30.

Температура колонки 160°С, испарителя 175°С.

При указанных условиях хроматографирования время удерживания фоксима 2,1 мин. При этом пик МНФ размытый, время удерживания 4,1 мин.

2.5.3.2. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков, расчет ведут до формуле:

, где

X - содержание пестицида в пробе, мг/кг

А - количество пестицида в стандартном растворе, введенном в хроматограф, мкг/мл.

- объем стандартного раствора пестицида, введенного в хроматограф, мкл

- высота пика стандартного раствора пестицида, мм

- высота пика пестицида в пробе, мм

- объем пробы, введенный в хроматограф, мкл

V - общий объем экстракта после упаривания и разведения, мл

Р - масса анализируемой пробы, г

2.5.4. Тонкослойнохроматографический анализ

Для подтверждения структуры исследуемых соединений после предварительной идентификации хромато-энзимным методом используется также метод хроматографии в тонким слое (см. рис. 2.1.1.)

2.5.4.1. Очистка экстракта.

Ацетоновый экстракт (5 мл), полученный как описано в п. 2.5.1. упаривают на ротационном испарителе под вакуумом при комнатной температуре досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл этанола и вымораживают при 0°С в течение 30 мин. Выпавшие хлопья отфильтровывают через бумажный фильтр, раствор переносят в пробирку со шлифом емкостью 5 мл, упаривают растворитель под вакуумом на ротационном испарителе (t бани 45°С) до ~ 0,3 мл и проводят определение методом хроматографии в тонком слое.

2.5.4.2. Определение хлорофоса и ДДВФ

Остаток из пробирки количественно переносят на хроматографическую пластинку. Используют пластинки с тонким слоем силикагеля КСК с крахмалом, приготовленные как описано в п. 2.4.2.2. На эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида в количестве 4-20 мкг. Подвижный растворитель н-гексан:ацетон 1:1; для обнаружения используют раствор резорцина. После опрыскивания пластинку помещают в сушильный шкаф при температуре 100°С на 5-7 мин. Хлорофос и ДДВФ проявляются в виде оранжевых пятен с 0,34 и 0,56 соответственно. Нижний предел обнаружения каждого препарата 1 мкг.

2.5.4.3. Определение МНФ и фенитрооксона

Остаток из пробирки количественно переносят на хроматографическую пластинку, Используют пластинки с тонким слоем силикагеля КСК с гипсом и добавкой цинковой пыли, как описано в п. 2.4.2.3. На эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида в количестве 4-20 мкг. Подвижный растворитель н-гексан-ацетон 4:1; для обнаружения используют раствор п-диметиламинобензальдегида. После опрыскивания пластинку термостатируют при 100-120°С в течение 5-7 мин. Метилнитрофос и фенитрооксон проявляются в виде желтых пятен на белом фоне с 0,41 и 0,24 соответственно. Нижний предел обнаружения каждого 2 мкг.

2.5.4.4. Определение карбофоса.

Остаток из пробирки количественно переносят на хроматографическую пластинку. Используют пластинки с тонким слоем силикагеля КСК с крахмалом, приготовленные как описано в п. 2.4.2.2. На эту же пластинку наносят стандартные растворы пестицида 4-20 мкг. Подвижная фаза хлороформ; для обнаружения используют бромфеноловый реактив. Через 10 мин после опрыскивания этим реактивом фон обесцвечивают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Препарат проявляется в виде синих пятен на светлом фоне 0,46. Нижний предел обнаружения 1 мкг. Этим же реактивом проявляются фоксим и МНФ, имеющие в указанных условиях хроматографирования 0,85 и 0,91. При наличии последних их идентифицируют методом ГЖХ, как было описано в п. 2.5.3.

2.5.4.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят путем сравнения проб со стандартами. При концентрациях 1-20 мкг для исследуемых пестицидов наблюдается пропорциональная зависимость концентрации от площади пятна. При большем содержании пестицидов берут аликвотную часть пробы. Содержание каждого вещества в пробе рассчитывают по формуле:

, где

Х - содержание пестицида в пробе, мг/кг

А - содержание пестицида в стандарте, мкг

- площадь пятна стандарта,

- площадь пятна пробы,

Р - масса пробы, взятая для анализа, г.

2.6 Обработка результатов анализа приведена в 2.5.2.5., 2.5.3.2., 2.5.4.5.

3. Требования безопасности

Соблюдаются требования безопасности, рекомендуемые для работы с химическими реактивами.

4. Методические указания разработаны во ВНИИ гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, г. Киев. Авторы: Письменная М.В., Клисенко М.А.

Заместитель Главного Государственного санитарного врача СССР

А.И. Заиченко