Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 7889-2015 "Йогурт. Подсчет характерных микроорганизмов. Методика подсчета колоний микроорганизмов после инкубации при температуре 37°С" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 июля 2016 г. N 824-ст)

Yogurt. Enumeration of characteristic microorganisms. Colony-count technique after incubation at 37°C

Дата введения - 1 июля 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен научно-производственным республиканским унитарным предприятием "Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации" (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5

2 Внесен Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. N 75-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по MK (ИСО 3166) 004-97	Код страны по MK (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 июля 2016 г. N 824-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 7889-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 7889:2003/IDF 117:2003 "Йогурт. Подсчет характеристических микроорганизмов. Метод определения количества колоний при 37°С" ("Yogurt - Enumeration of characteristic microorganisms - Colony-count technique at 37°C", IDT).

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 "Молоко и молочные продукты" Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) совместно с Международной ассоциацией химиков-аналитиков (АОАС International).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

В разделе "Нормативные ссылки" и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета характерных микроорганизмов в йогурте посредством подсчета колоний микроорганизмов при температуре 37°С.

Метод применим к йогуртам, в которых присутствуют жизнеспособные микроорганизмы (видов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophillus).

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination - Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятикратных разведений)

ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

ISO 8261:2001 | IDF 122:2001* Milk and milk products - General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты. Общее руководство по подготовке образцов для испытания, исходных суспензий и децимолярных растворов для микробиологического исследования)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 характерные микроорганизмы в йогурте (characteristic microorganisms in yogurt): Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophillus, обнаруживаемые в условиях, описанных в настоящем стандарте.

3.2 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus: Термофильный микроорганизм, образующий чечевицеобразные часто заостренные колонии диаметром 1 - 3 мм на подкисленной среде (MRS) в условиях, описанных в настоящем стандарте.

Примечание - Под микроскопом эти микроорганизмы выглядят как палочки, обычно короткие, но иногда имеют удлиненную форму. Они не образуют спор, грамположительные, неподвижные и каталазонегативные.

3.3 Streptococcus thermophillus: Термофильный микроорганизм, образующий чечевицеобразные колонии диаметром 1 - 2 мм в среде М17 в условиях, описанных в настоящем стандарте.

Примечание - Под микроскопом эти микроорганизмы выглядят как сферические или овоидные клетки (диаметром 0,7 - 0,9 мкм), располагаемые парами или длинными цепочками. Грамположительные и каталазонегативные.

4 Сущность метода

4.1 Десятикратное разведение исследуемого образца инокулируют в:

a) подкисленную среду (MRS), далее инкубируют в аэробных условиях при температуре 37°С1°С в течение 72 ч, подсчитывают количество Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;

b) полную среду (M17) далее инкубируют в аэробных условиях при температуре 37°С1°С в течение 48 ч, подсчитывают количество Streptococcus thermophillus.

4.2 Колонии подсчитывают и подтверждают полученные результаты посредством проведения соответствующих испытаний.

4.3 Число характерных микроорганизмов на грамм образца рассчитывают, исходя из количества колоний, полученных на чашках, при таких уровнях разведения, которые дают значимый результат.

5 Питательная среда, разбавители и реактивы

Используют только признанные аналитически чистые реактивы, дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты по ISO 6887-1 и ISO 8261 /IDF 122.

5.1 Разбавитель

Разбавитель по ISO 6887-1 и ISO 8261 / IDF 122.

5.2 Питательная среда

Используют свежеприготовленную питательную среду (MRS и М17), которую нельзя подвергать воздействию прямого солнечного света.

Если приготовленные питательные среды используют не сразу, то их охлаждают и хранят при температуре 2 - 4°С не более 1 недели в условиях, которые не изменяют их состава.

Условия хранения установлены в ISO 7218.

5.2.1 Окисленная среда MRS (см. [7])

5.2.1.1 Состав

Пептон 1 (триптический гидролизат казеина), г	10,0
Мясной экстракт, г	10,0
Дрожжевой экстракт (сухой), г	5,0
Глюкоза (), г	20,0
Твин 80 (сорбитан моноолеат),	1,0
Двузамещенный фосфорнокислый калий ( ), г	2,0
Натрия ацетат тригидрат (), г	5,0
Цитрат диаммония [], г	2,0
Гептагидрат сульфата магния (), г	0,2
Сульфат марганца тетрагидрат ), г	0,05
Агар, г**	9,0 - 18,0
Вода в объеме до,	1000

5.2.1.2 Приготовление

Каждый компонент растворяют отдельно на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до температуры 50°С. Используя уксусную кислоту (5.3.3), корректируют уровень рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 5,40,1 ед. рН при измерении при помощи рН-метра (6.8) при температуре 25°С1°С. Среду переносят по 100  во флаконы вместимостью 150  (6.10) или по 200  во флаконы вместимостью 250  (6.10). Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121°С 1°С.

Примечания

1 Среда MRS высокочувствительна к тепловой обработке, которая может вызвать различия в зависимости от используемого автоклава.

2 Сличительные испытания показали, что коммерчески доступные среды MRS могут дать число микроорганизмов, которое меньше числа, наблюдаемого в среде MRS, приготовленной согласно настоящему стандарту. Поэтому в случае использования коммерчески доступной среды MRS ее следует проверить в сравнении со средой, приготовленной согласно настоящему стандарту.

До начала проведения бактериологического исследования полностью расплавляют необходимое количество среды на водяной бане (6.7) при температуре кипения или путем обработки паром в закрытом контейнере. Затем охлаждают на другой водяной бане (6.7).

5.2.2 Среда М17 (см. [8])

5.2.2.1 Основная среда

5.2.2.1.1 Состав

Пептон 1 (триптический гидролизат казеина), г	2,5
Пептон 2 (пептический гидролизат мяса), г	2,5
Пептон 3 (папаиновый гидролизат сои), г	5,0
Дрожжевой экстракт (сухой), г	2,5
Мясной экстракт, г	5,0
-глицерофосфат (динатриевая соль) (), г	19,0
Гептагидрат сульфата магния (), г	0,25
Аскорбиновая кислота (), г	0,50
Агар, г**	9,0 - 18,0
Вода в объеме до,	950

5.2.2.1.2 Приготовление

Отдельно растворяют каждый компонент на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до 50°С. Корректируют уровень рН таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 6,80,1 ед. рН при температуре 25°С1°С, используя реактив (5.3) и проверяют уровень рН при помощи рН-метра (6.8). Среду переносят по 95  во флаконы вместимостью 150  (6.10). Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121°С1°С.

5.2.2.2 Раствор лактозы

5.2.2.2.1 Состав

Лактоза (), г	10,0
Вода в объеме до,	100

5.2.2.2.2 Приготовление

Растворяют лактозу в воде. Разводят водой до 100 . Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121°С1°С.

5.2.2.3 Полная среда (М17)

5.2.2.3.1 Состав

Основная среда (5.2.2.1),	95,0
Раствор лактозы (5.2.2.2),	5,0

5.2.2.3.2 Приготовление

Непосредственно перед использованием расплавляют основную среду на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до температуры 50°С. Предварительно нагревают раствор лактозы на водяной бане (6.7), установленной на температуру 50°С. Добавляют раствор лактозы в основную среду и перемешивают вихревыми движениями. Охлаждают среду на водяной бане до температуры 44 - 47°С.

Примечание - Полная среда М17 доступна в продаже, но может показать результаты, существенно отличающиеся в зависимости от поставщика. Поэтому в случае использования коммерчески доступной среды М17 ее следует проверить в сравнении со средой, приготовленной согласно настоящему стандарту.

5.3 Реактивы для корректировки рН

5.3.1 Раствор гидроокиси натрия, c(NaOH) = приблизительно 0,1 .

5.3.2 Разведенная соляная кислота, c(HCI) = приблизительно 0,1 .

5.3.3 Уксусная кислота (), 100% (ледяная).

5.4 Реактив для окрашивания, этиловый раствор метиленового синего, 6 .

5.5 Реактив для очистки поверхности контейнера, этанол 70% (объемная доля).

6 Оборудование и посуда

Стерилизацию оборудования, контактирующего с исследуемым образцом, разбавителем, разведениями или питательной средой, проводят согласно требованиям ISO 8261 | IDF 122. Лабораторная посуда должна быть устойчивой к многократной стерилизации.

Применяют обычное микробиологическое лабораторное оборудование (см. ISO 7218) для приготовления исследуемых образцов и разведений, указанное в ISO 8261 | IDF 122, в частности указанное ниже.

6.1 Инкубатор, поддерживающий температуру 37°С1°С.

6.2 Камера для анаэробной инкубации или анаэростаты, поддерживающие температуру 37°С1°С, обеспечивающие атмосферу с 90% азота и 10% углекислого газа.

6.3 Смеситель перистальтический (стомахер) со стерильными пластиковыми пакетами или роторный, работающий при минимальной частоте вращения 20000 об/мин, со стерильными круглодонными центрифужными пробирками из упрочненного стекла вместимостью 200  или металлическими контейнерами соответствующей емкости.

6.4 Мешалка для пробирок, например, вортекс.

6.5 Прибор для подсчета колоний, указанный в ISO 7218.

6.6 Лупа с увеличением от 8 до 10.

6.7 Водяные бани, способные поддерживать температуру 44 - 47°С, 45°С1°С, 50°С1°С и работать в режиме кипения.

6.8 Прибор для измерения рН, способный обеспечивать измерения с точностью до 0,1 ед. рН при температуре 25°С1°С (см. ISO 7218).

6.9 Флаконы для разведения вместимостью 50 - 250  или пробирки для испытаний диаметром и длиной 18 180 мм, с подходящими уплотнительными колпачками или пробками из резины или синтетического материала.

6.10 Колбы или флаконы с резиновыми пробками или крышками вместимостью 150 - 250 .

6.11 Пробирки для испытаний с резиновыми пробками или крышками вместимостью 20  для питательной среды.

6.12 Градуированные пипетки для бактериологического использования, стерилизованные, с одной меткой (выдувные), с широкими отверстиями, номинальной вместимости (10,02) и (100,2) (см. ISO 6887-1).

6.13 Чашки Петри из прозрачного бесцветного стекла или пластика диаметром 90 - 140 мм, с внутренней глубиной не менее 10 мм. Дно не должно иметь неровностей, которые могли бы помешать подсчету колоний.

6.14 Палочка стеклянная или металлическая, стерилизованная.

7 Отбор проб

В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Во время транспортирования и хранения не допускаются какое-либо ее изменение или порча.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в [I].

8 Подготовка пробы для испытания

Пробу для испытания готовят согласно ISO 8261.

Перед открытием упаковки с йогуртом необходимо соблюдение следующих мер предосторожности. Очищают внешнюю поверхность, окружающую ту область, из которой будет взята проба, с целью удаления любого вещества, которое может загрязнить пробу. Этот участок протирают 70% этанолом (5.5) с целью предотвращения дальнейшего загрязнения. Контейнер открывают в асептических условиях.

9 Проведение испытания

9.1 Приготовление навески

9.1.1 Общие положения

Общие требования приведены в ISO 8261 | IDF 122.

9.1.2 Йогурты без фруктовых наполнителей

Тщательно перемешивают содержимое упаковки с йогуртом, используя стерильную палочку (6.14). Взвешивают (100,1) г исследуемого образца в соответствующий контейнер [например, в круглодонную центрифужную пробирку из упрочненного стекла вместимостью 200 , или в чашу роторного смесителя, или в пластиковый контейнер перистальтического смесителя (6.3)].

9.1.3 Йогурты с фруктовыми наполнителями

Перемешивают содержимое упаковки с йогуртом в течение 1 мин., используя смеситель (6.3). Отвешивают (100,1) г исследуемого образца в соответствующий контейнер согласно 9.1.2.

9.2 Микроскопическое исследование

Проводят микроскопическое исследование нескольких полей препарата, приготовленного из исследуемого образца (раздел 8) и предварительно окрашенного метиленовым синим (5.4), с целью определения количества двух видов бактерий (кокков и палочек) и выбора необходимого диапазона разведений, который будет использован для посева каждого вида бактерий.

9.3 Приготовление первого разведения

По ISO 8261 /IDF 122.

Операции, описанные в 9.3 - 9.6.4, не проводят под прямым солнечным светом.

К навеске (9.1.1 или 9.1.2) добавляют разбавитель (5.1) до получения массы навески и разбавителя 50 г. Перемешивают в течение 1 мин. на смесителе (6.3). Разводят до 100 г разбавителем до получения степени разведения .

9.4 Приготовление десятикратных разведений

По ISO 8261 /IDF 122.

9.5 Длительность процедуры

См. ISO 8261 / IDF 122.

9.6 Инокуляция и инкубация

9.6.1 Стерильной пипеткой (6.12) переносят по 1  каждого разведения в чашки Петри (6.13) отдельно для определения L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophillus (по две чашки Петри на каждое испытание).

9.6.2 Чашки Петри (6.13) с инокулятом для определения L. delbrueckii subsp. bulgaricus заливают 15  подкисленной среды MRS (5.2.1), выдержанной на водяной бане (6.7) при температуре 45°С.

9.6.3 Чашки Петри (6.13) с инокулятом для определения S. thermophillus заливают 15  среды М17 (5.2.2), нагретой на водяной бане (6.7) при температуре 44 - 47°С.

9.6.4 Тщательно перемешивают инокулят со средой, вращая чашки Петри (9.6.2 или 9.6.3). Дают смеси затвердеть, оставив чашки Петри на горизонтальной холодной поверхности.

9.6.5 Инкубируют подготовленные чашки в перевернутом положении. Складывают не более шести в высоту. Стопки чашек должны быть отделены друг от друга, от стенок и от верха инкубатора (6.1).

9.6.6 Инкубируют чашки, которые будут использованы для подсчета L. delbrueckii subsp. bulgaricus, в камере для анаэробной инкубации или анаэростате (6.2) в инкубаторе (6.1), установленном на температуру 37°С, в течение 72 ч.

9.6.7 Инкубируют чашки, которые будут использованы для подсчета S. thermophillus, в инкубаторе (6.1), установленном на температуру 37°С, в течение 48 ч.

9.7 Подсчет колоний

9.7.1 После определенного периода инкубации (9.6.6 и 9.6.7) подсчитывают количество колоний со свойствами, характерными для каждого микроорганизма [Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (3.2) и Streptococcus thermophillus (3.3)] в чашках с 15 - 300 колониями (см. приложение А).

Примечание - В случае проблем с подсчетом L. delbrueckii subsp. bulgaricus при использовании среды MRS можно использовать среду LBA, разработанную в NIZO***; см. также приложение А.

9.7.2 Чашки исследуют при приглушенном свете. Для упрощения подсчета можно использовать соответствующее оборудование для подсчета колоний (6.5). Соблюдают осторожность, чтобы не принять частицы нерастворенного образца или осажденного вещества за обнаруженные колонии. Внимательно исследуют сомнительные объекты, используя линзы (6.6) с большим увеличением, с целью различения колоний и постороннего вещества.

9.8 Подтверждение

Для подсчета выбирают такое количество колоний, чтобы их число равн