Приложение 2. Рецепты питательных сред

Приложение 2

Рецепты питательных сред

Печеночные среды

Свежую говяжью печень освобождают от жира и пленок и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой (на 1 кг фарша - 1 л воды) и настаивают при температуре 25-30°С в течение 3 ч или при температуре 4-10°С в течение 6-10 ч. Затем смесь перемешивают и автоклавируют текучим паром в течение 20 мин. Можно варить и в котле, постоянно помешивая в течение одного часа после закипания. В процессе варки снимают накипь. После варки настой фильтруют через тонкий ватно-марлевый фильтр.

Приготовленный таким образом печеночный настой разливают по бутылям и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 115-120°С.

Печеночный бульон

К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды, 10 г сухого пептона и 5 г химически чистого хлористого натрия. Смесь кипятят, устанавливают рН 7,4, фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют 20 мин при температуре 115-120°С, рН бульона после стерилизации должен быть 7,1-7,2.

Печеночный агар

К 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды, 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара, промытого водопроводной водой и хорошо отжатого, рН среды устанавливают 7,8. Затем среду варят до полного расплавления агара и разливают в необходимую посуду (по 1-2 л).

В дальнейшем среду автоклавируют при температуре 115°С в течение 20 мин, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой и вновь устанавливают рН 7,1-7,2.

Среду разливают в необходимую по емкости посуду и стерилизуют при температуре 115°С в течение 20 мин.

Мясопептонные среды

Мясная вода

Свежее говяжье мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Фарш заливают водопроводной водой из расчета 500 г фарша на 1 л воды и выдерживают в течение 15 ч в прохладном месте.

В дальнейшем настой варят 30-40 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

Полученную мясную воду стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин.

Мясопептонный бульон

На 2 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона и 5 г химически чистого хлористого натрия. Смесь подщелачивают до рН 7,4 и кипятят в течение 20 мин. После этого фильтруют через бумажный фильтр, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин, рН среды после стерилизации должен быть 7,2.

Мясопептонный агар

К 1 л мясной воды добавляют 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 25 г агар-агара. Смесь подщелачивают до рН 7,8, варят до полного расплавления агара. Затем автоклавируют при температуре 120°С в течение 30 мин для стерилизации и расплавления агара. После стерилизации среду отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, предварительно смоченный теплой водой, корректируют рН среды до 7,2, разливают в необходимую посуду и вновь стерилизуют 20-30 мин при температуре 110°С.

Сывороточно-декстрозный агар

Основой среды является питательный агар, который готовят следующим образом: к 835 мл дистиллированной воды добавляют 10 г агара микробиологического, 10 г пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия и 165 мл мясной воды. Все ингредиенты помещают в сосуд, устанавливают рН 7,8 и кипятят 2-3 минуты до полного расплавления агара. Затем сосуд ставят в автоклав и подвергают одномоментному давлению 1 атмосферы при температуре 121°С в течение 20 мин для выпадения в осадок фосфатов. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,4, а затем разливают в мерную посуду и стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин. Заготовленный таким образом питательный агар по мере надобности расплавляют в водяной бане или автоклаве и охлаждают до 50°С. Затем к нему добавляют нормальную инактивированную (при температуре 56°С 30 мин) лошадиную или бычью сыворотку и раствор декстрозы, предварительно простерилизованный путем фильтрации через фильтр Зейтца так, чтобы окончательная концентрация сыворотки была 5% и декстрозы - 1%.

Кровяной агар

Основой среды является питательный агар, применяемый при изготовлении сывороточно-декстрозной среды.

Для приготовления кровяного агара к основной среде добавляют 5% крови бараньей дефибринированной.

Картофельная среда

Крупный отборный картофель моют и очищают. На 1 кг картофеля добавляют 1 л дистиллированной воды и варят до готовности картофеля. Затем жидкость сливают, замеряют объем, доливают дистиллированной водой до 1 л и фильтруют через двойной марлевый фильтр. После этого добавляют следующие ингредиенты: пептон - 10 г, химически чистый хлористый натрий - 5 г, глицерин - 30 мл и агар микробиологический - 10 г. Все помещают в кастрюлю и варят до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2 10%-м раствором едкого натрия.

Затем проводят стерилизацию в автоклаве при температуре 121°С в течение 20 мин, фильтруют, добавляют 10 г глюкозы и вновь стерилизуют при температуре 121°С 20 мин. После автоклавирования к среде добавляют 10% нормальной инактивированной стерильной лошадиной или овечьей сыворотки.

Среда "Д"

а) Бульон "Д"

К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 2,5 г порошка стандартного бульона "Д", прогревают и тщательно размешивают до полного его растворения. Затем бульон фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при температуре 120°С в течение 20 мин (рН среды 7,1-7,2).

б) Агар "Д"

К 100 мл холодной дистиллированной воды добавляют 5 г порошка стандартного агара "Д", прогревают при помешивании до полного растворения порошка, не допуская его подгорания, затем фильтруют, разливают в необходимую посуду и стерилизуют при температуре 120°С в течение 20 мин (рН среды 7,2).

Среда - заменитель "Альбими"-агара

К 1 л дистиллированной воды добавляют 20 г сухого пептона, 20 мл дрожжевой воды, 5 г химически чистого хлористого натрия и 20 г агар-агара, устанавливают рН 7,3.

Затем все растворяют в автоклаве под текучим паром и фильтруют через ватно-марлевый фильтр (предварительно смоченный теплой водой и хорошо отжатый).

Затем добавляют 1 г глюкозы и 0,1 г бисульфита натрия, устанавливают рН 7,2-7,3. Разливают в необходимую посуду и стерилизуют 40 мин под текучим паром, а потом при температуре 110°С в течение 20 мин.

Дрожжевая вода

К 1 л дистиллированной воды добавляют 1 кг хлебных дрожжей и кипятят до растворения. Затем фильтруют через полотняный фильтр. Хранить под хлороформом в темноте не более двух недель.

Среда для культивирования В. ovis

Основой среды является печеночный или мясопептонный агар, к которому добавляют 1% декстрозы (глюкозы) и 2% глицерина. Среду разливают в необходимую посуду и стерилизуют при температуре 116°С в течение 15 мин. Перед посевом к расплавленной и остуженной до 50°С среде добавляют 20% нормальной сыворотки крупного рогатого скота или 10% аминопептида и 10% сыворотки.

Среда для выделения и культивирования L-форм бруцелл

Основой среды является питательный агар, который готовится с использованием печеночного настоя.

Для приготовления агара (из расчета на 1 л среды) к 500 мл печеночного настоя добавляют 500 мл водопроводной воды и 10 г сухого пептона, 5 г химически чистого хлористого натрия, 30 г микробиологического агара. Устанавливают рН 7,8.

Смесь кипятят до полного расплавления агара, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин, отстаивают, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, смоченный теплой водой. После фильтрации добавляют 10 г глицерина и 10 г глюкозы, устанавливают рН 7,2 и стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин.

Заготовленный агар перед посевом крови расплавляют в водяной бане, охлаждают до температуры 50°С и добавляют 25% нормальной лошадиной сыворотки (предварительно простерилизованной через фильтр Зейтца), 25% печеночного агара, содержащего 50-100 ЕД пенициллина на 1 мл среды.

Посев крови в объеме не менее 5 мл, пунктатов костного мозга и лимфоузлов проводят на питательную среду сразу же после застывания агара.

Среда для выделения L-форм бруцелл на основе печеночного настоя (плотная)

Микробиологический агар - 12,0-12,5 г

Натрия хлорид - 5,0-5,5 г

Натрия гидроокись - 2,0-2,5 г

Магния сульфат - 20,0-20,5 г

Сахароза - 100,0-100,5 г

Глицерин - 10,0-10,5 г

Кристаллический фиолетовый - 0,025-0,03 г

Нормальная лошадиная сыворотка - 100,0-200,0 мл

Бициллин-3 - 3 000 ЕД/мл

Печеночный настой - 18,0-18,5 мл

Пептон ферментативный - 10,0-10,5 г

Вода дистиллированная - до 1 л

Навеску, содержащую компоненты среды в указанных выше количественных соотношениях, растворяют в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения при помешивании и кипятят в течение 2-3 мин. Затем среду охлаждают до температуры , добавляют 100-200 мл нормальной лошадиной сыворотки и бициллин-3 (3 000 ЕД/мл), тщательно перемешивают и разливают в стерильную посуду.