Приложение 2. Методики приготовления питательных сред для культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций

Приложение 2

Методики приготовления питательных сред для
культивирования тест-микобактерий, предназначенных для изучения и оценки туберкулоцидной активности дезинфицирующих средств и их субстанций

Методика приготовления среды Миддлбрука 7Н9 (бульон) с 10% ростовой добавки ADC (MADC-бульон для хранения замороженных культур при -70°С):

- миддлбрук 7Н9 порошок бульона - 4,7 г;

- глицерин - 100,0 мл;

- вода (стерильная, дистиллированная) - 750,0 мл.

Ингредиенты соединить, перемешать, стерилизовать в паровом стерилизаторе при 1,1 атм (121°С) в течение 10 мин, охладить до 45°С. Добавить в асептических условиях 100 мл ростовой добавки ADC и стерильной дистиллированной воды до 1 000,0 мл.

рН среды будет эквивалентен в бульоне, остывшем до 25°С.

Методика приготовления среды Левенштейна-Йенсена.

Среда Левенштейна-Йенсена - международная среда, широко используемая в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Это плотная яичная среда, на которой видимый рост М. terrae получают приблизительно на 14-21-й день после посева.

Для чистоты эксперимента желательно использовать готовую питательную среду в стандартных пробирках с завинчивающимися крышками.

При невозможности приобретения готовой среды, ее можно приготовить самостоятельно.

В состав среды Левенштейна-Йенсена входят следующие компоненты:

1. Раствор минеральных солей:

- калий однозамещенный фосфорнокислый - 2,4 г;

- магний лимоннокислый - 0,6 г;

- магний сернокислый - 0,24 г;

- L-аспарагин - 3,6 г;

- глицерин - 12,0 мл;

- вода дистиллированная - 600 мл.

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогреве (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм (121°С) в течение 20-30 мин. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

2. Раствор малахитового зеленого:

- малахитовый зеленый - 2 г;

- стерильная дистиллированная вода - 100 мл.

Взвешенный порошок малахитового зеленого растворяют в стерильной теплой дистиллированной воде и помещают раствор в термостат на 1 - 2 - 2,5 ч для большего растворения. Затем фильтруют раствор через бумажный фильтр, разливают по флаконам или небольшим колбам и стерилизуют в паровом стерилизаторе при 1 атм (121°С) в течение 30 мин. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его заменяют свежим раствором.

3. Яичная масса.

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, затем оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70%-й этиловый спирт на 30 мин. Перед тем как начать работу с чистыми и сухими яйцами, рекомендуется тщательно вымыть руки с мылом и щеткой. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц, в зависимости от их величины). Тщательно взбивают яичную массу стерильным венчиком или в стерильном миксере при минимальной скорости.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость, соблюдая правила асептики, помещают следующие растворы:

- раствор минеральных солей - 600 мл;

- гомогенизированная яичная масса - 1 000 мл.

Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через 4-слойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 мин разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не сформировался осадок.

Коагуляция (свертывание) среды.

Для свертывания среды используют специальные аппараты-свертыватели типа "АСПС". Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования скошенной поверхности среды высотой 8-10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 85°С в течение 45 мин.

Хранение среды.

Готовую питательную среду проверяют на стерильность, помещая 10 пробирок из вновь приготовленной партии в термостат при 37°С на 3 суток. По истечении времени инкубации в пробирках на питательной среде должен отсутствовать микробный рост. В случае наличия роста приготовленная партия среды подлежит уничтожению. Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

Методика приготовления среды "Новая".

Среда "Новая" - это плотная яичная среда, на которой хороший рост колоний М. terrae получают приблизительно на 5-7-й день после посева материала (проб).

В рецептуру питательной среды "Новая" входят следующие компоненты (в весовых %):

- калий фосфорнокислый одноосновной - 0,05;

- натрий лимоннокислый - 0,05;

- магний сернокислый - 0,05;

- натрий пировинограднокислый (гликокол) - 0,2;

- глицерин - 3,6;

- малахитовая зелень - 0,036;

- желтки яиц - 50,0;

- дистиллированная вода - до 100,0.

Способ получения концентрированной питательной среды заключается в смешивании сухих навесок ингредиентов солей (кроме бактерицидного красителя) с желточной массой, обработке ингредиентов 70° этиловым спиртом, растворении бактерицидного красителя в глицерине и соединении всех компонентов среды.

Для получения 1 л концентрированной питательной среды необходимо:

- сделать навески: однозамещенного фосфорнокислого калия - 1 г, лимоннокислого натрия - 1 г, сернокислого магния - 1 г, натрия пировинограднокислого (гликокола) - 4 г, и каждую навеску поместить в стерильную фарфоровую ступку;

- обеззаразить навески путем смачивания каждой навески 1 мл 70° этилового спирта. Затем поместить ступки с навесками в термостат при температуре 37°С и высушить при периодическом помешивании в течение 45 мин;

- приготовить 1 л желточной массы. 50 штук куриных яиц обработать снаружи с целью обеззараживания 70° спиртом. Затем отделить белок от желтка. Перенести желточную массу в мерную колбу и тщательно гомогенизировать;

- приготовить желточно-солевую смесь. К 1 л желточной массы (п. 3) добавить обеззараженные навески (п. 2) и перемешать;

- приготовить раствор бактерицидного красителя. Навеску 700 мг малахитовой зелени смочить 1 мл 70° спирта и соединить с 70 мл глицерина (это соответствует 1%-му раствору малахитового зеленого в глицерине).

Получение концентрированной питательной смеси.

Производят соединение 1 л желточно-солевой смеси с 70 мл 1%-го раствора малахитового зеленого в глицерине (п. 5) и тщательно гомогенизируют. Полученную концентрированную питательную смесь (среду) выдерживают в течение суток при комнатной температуре и разливают среду во флаконы емкостью 250 мл, которые герметично упаковывают и маркируют. Укупоренные флаконы с концентрированной питательной средой хранят в холодильнике при 3-5°С в течение 3-4 недель.

Приготовление рабочей (используемой при тестировании дезсредств) плотной питательной среды в пробирках.

К концентрированной питательной среде добавляют равный объем стерильной дистиллированной воды (1:1), гомогенизируют, разливают по 5 мл в пробирки. Для образования скоса питательной среды пробирки укладывают в наклонном положении в свертыватель, предварительно нагретый до 90°С. Среду коагулируют 20 мин при температуре 82-83°С. Контроль приготовленной партии среды на стерильность осуществляют так же, как описано для среды Левенштейна-Йенсена.

Хранение пробирок с питательной средой.

Пробирки с питательной средой могут храниться в холодильнике при температуре 5°С в течение 4 недель. При длительном хранении необходимо пробирки герметично укупорить и поместить в полиэтиленовые пакеты, чтобы предотвратить высыхание среды.