Приложение В (обязательное). Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Приложение В
(обязательное)

Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Диапазон измерений массовой доли лактозы в продукте - от 0,05% до 100,0%.

B.1 Сущность метода

Метод основан на определении лактозы в фильтрате, полученном после удаления из пробы жира и белка, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении на анионообменной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой доли лактозы в стандартном образце, используя градуировочный график.

B.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы:

- колонку анионобменную# длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 78 мм;

- предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную катионом в гидрогенной форме;

- предколонку длиной 300 мм, с размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную анионом в карбонатной форме;

- детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более единиц рефракции;

- мешалку магнитную;

- насос, способный пропускать раствор со скоростью 0,3 - 0,6 , с пульсацией не более 1% при давлении на колонку от 1,5 МПа до 4,0 МПа;

- термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры элюента (852)°С;

- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 ;

- программу компьютерную для статистической обработки результатов типа "Мультихром", версия 1.5 и выше со встроенным интегратором.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания 0,001 г, 0,2 мг.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040 - 1,000  с относительной погрешностью дозирования 1%.

Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 .

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 .

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин.

Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры вместимостью 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одним делением 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Колбы П-1-50-19/26 ТС (-1-25-19/26 ТС) по ГОСТ 25336.

Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Прибор для фильтрования стеклянный с фильтром с размером диаметра 0,45 мкм.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см.

Фильтры мембранные с размером диаметра пор не более 0,5 мкм.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.

Образец стандартный лактозы, массовой долей основного вещества не менее 99,0%.

Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по действующей нормативной документации.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

B.3 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26809.1.

B.4 Подготовка к проведению измерений

В.4.1 Подготовка стандартного раствора углевода

В мерную колбу вместимостью 100  помещают 1 г стандартного образца лактозы с записью результата до четвертого знака после запятой и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре от 4°С до 6°С - не более 7 сут.

B.4.2 Подготовка градуировочных растворов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов в количестве не менее пяти путем разбавления стандартного раствора углевода по 4.1.

В четыре мерные колбы вместимостью 100  помещают 50 , 25 , 15 , 10  стандартного раствора углевода (4.1). Объем растворов доводят бидистиллированной водой до метки.

В.4.2.1 Все растворы готовят перед определением.

B.4.3 Подготовка подвижной фазы

Дегазацию растворенного в подвижной фазе воздуха проводят с помощью водоструйного или вакуумного насоса, обрабатывая бидистиллированную воду ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности, избегают вспенивания воды.

Подвижную фазу готовят в день определения.

B.4.4 Подготовка анализируемой пробы продукта

B.4.4.1 (1,000 0,001) г сухого продукта помещают в мерную колбу вместимостью 100 . Мерным цилиндром приливают 20  бидистиллированной воды и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и снова тщательно перемешивают. Затем центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин и фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.2 (10,0000,001) г сгущенного продукта помещают в мерную колбу вместимостью 100 . Мерным цилиндром приливают 20  бидистиллированной воды и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и снова тщательно перемешивают. Затем центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин и фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.3 Жидкую сыворотку помещают в центрифужные пробирки соответствующего объема и центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин. Затем фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.4 Для анализа используют водную фракцию

B.4.5 Подготовка хроматографа

Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

B.4.5.1 Условия хроматографирования:

- скорость потока - (0,3 - 0,6) ;

- температура - 85,0°С;

- подвижная фаза: бидистиллированная вода;

- детектор: рефрактометрический.

B.4.5.2 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика измеряют площади пиков, соответствующие массовым долям углевода в градуировочных растворах. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее трех раз. Измерения выполняют последовательно, начиная с растворов с наименьшей массовой концентрацией определяемого вещества.

Полученные при хроматографировании значения не должны отклоняться от стандартных не более, чем на 5,00%.

По полученным данным, используя программные обеспечения к приборам, рассчитывают коэффициенты регрессии а и b прямой .

Градуировочный график строят с учетом вычисленных значений уравнения:

,

(1)

где Y - площадь пика углевода;

а и b - коэффициенты регрессии;

- массовая доля углевода в градуировочном растворе, %.

В.4.5.3 Градуировку проводят не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок или ремонте хроматографа.

B.5 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего воздуха ..............(205)°С;

относительная влажность воздуха ..............(5525)%;

атмосферное давление .........................(9610) кПа;

частота переменного тока .....................(505) Гц;

напряжение в сети ............................(22010) В.

Для проведения измерений применяют бидистиллированную воду, которую готовят следующим образом: дистиллированную воду фильтруют через мембранный фильтр (размер диаметра пор не более 0,5 мкм), затем кипятят для удаления растворенного воздуха и охлаждают до комнатной температуры.

B.6 Проведение измерений

В.6.1 Дегазация анализируемой пробы

В мерную колбу вместимостью 50  помещают 3  фильтрата по 4.4. Дегазацию растворенного в фильтрате воздуха проводят с помощью вакуумного насоса, обрабатывая ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности, избегают вспенивания.

В.6.2 В инжектор хроматографа вводят от 0,02  тщательно отмеренного дегазированного фильтрата со скоростью потока (0,3 - 0,6) .

В.7 Обработка результатов измерений

В.7.1 Массовую долю лактозы в сухой пробе продукта , %, вычисляют по формуле

,

(2)

где

- объем анализируемой пробы после разбавления по 4.4, ;

X - массовая доля углевода, рассчитанная по градуировочному графику (4.5.2), %;

0,02 - объем анализируемой пробы, взятый для анализа по 6.2, .

7.2 Массовую долю лактозы в жидкой и концентрированной пробе , %, вычисляют по формуле

,

(3)

где - общий объем анализируемой пробы после разбавления по 4.4, ;

- массовая доля углевода, рассчитанная по градуировочному графику (4.5.2), %;

- масса пробы, взятой для анализа (4.4), г.

В.7.3 Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу 8.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

В.8 Контроль точности результатов измерений

В.8.1 Метрологические характеристики метода определения массовой доли лактозы

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения массовой доли лактозы при Р = 0,95 приведены в таблице 1.

Таблица 1

Диапазон измерений массовой доли лактозы, %	Предел повторяемости ., %	Предел воспроизводимости , %	Границы относительной погрешности , %
0,05 - 100,00	9	17	12

В.8.2 Проверка приемлемости результатов определений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов определений массовой доли лактозы, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6. Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

,

(4)

где , - значения двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, %;

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, %;

- пределы повторяемости (сходимости), значения которых приведены в таблице 1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторное определение и проверку приемлемости результатов определений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6.

В.8.3 Проверка приемлемости результатов определения, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов определений массовой доли лактозы, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Результаты определений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии:

,

(5)

где , - результаты определений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, %;

- пределы воспроизводимости, значения которых приведены в таблице 1, %;

- среднеарифметическое значение результатов определений, выполненных в условиях воспроизводимости, %.

Если данное условие не выполняется, то процедуры повторяют в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-6.

В.9 Оформление результатов

Результат измерений массовой доли лактозы в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

,

(6)

где

- границы относительной погрешности измерений, % (таблица 1);

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, %.

В.10 Требования, обеспечивающие безопасность

При выполнении работ необходимо соблюдать следующие требования:

- помещение лаборатории должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных требованиями ГОСТ 12.1.005;

- требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.007;

- требования техники безопасности при работе с электроустановками в соответствии с требованиями ГОСТ Р 12.1.019;

- помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения в соответствии с требованиями ГОСТ 12.4.009.