Приложение В (обязательное). Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Приложение В
(обязательное)

Определение массовой доли лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Диапазон измерений массовой доли лактозы в продукте - от 0,05% до 100,0%.

B.1 Сущность метода

Метод основан на определении лактозы в фильтрате, полученном после удаления из пробы жира и белка, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении на анионообменной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой доли лактозы в стандартном образце, используя градуировочный график.

B.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы:

- колонку анионобменную# длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 78 мм;

- предколонку длиной 300 мм, размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную катионом в гидрогенной форме;

- предколонку длиной 300 мм, с размером внутреннего диаметра 46 мм, заполненную анионом в карбонатной форме;

- детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более единиц рефракции;

- мешалку магнитную;

- насос, способный пропускать раствор со скоростью 0,3 - 0,6 , с пульсацией не более 1% при давлении на колонку от 1,5 МПа до 4,0 МПа;

- термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры элюента (852)°С;

- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 ;

- программу компьютерную для статистической обработки результатов типа "Мультихром", версия 1.5 и выше со встроенным интегратором.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания 0,001 г, 0,2 мг.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040 - 1,000  с относительной погрешностью дозирования 1%.

Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 .

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 .

Центрифуга лабораторная, обеспечивающая скорость вращения не менее 15000 об/мин.

Колбы мерные 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры вместимостью 1-50-2, 1-100-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одним делением 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Колбы П-1-50-19/26 ТС (-1-25-19/26 ТС) по ГОСТ 25336.

Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Прибор для фильтрования стеклянный с фильтром с размером диаметра 0,45 мкм.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см.

Фильтры мембранные с размером диаметра пор не более 0,5 мкм.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.

Образец стандартный лактозы, массовой долей основного вещества не менее 99,0%.

Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по действующей нормативной документации.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

B.3 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26809.1.

B.4 Подготовка к проведению измерений

В.4.1 Подготовка стандартного раствора углевода

В мерную колбу вместимостью 100  помещают 1 г стандартного образца лактозы с записью результата до четвертого знака после запятой и растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре от 4°С до 6°С - не более 7 сут.

B.4.2 Подготовка градуировочных растворов

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов в количестве не менее пяти путем разбавления стандартного раствора углевода по 4.1.

В четыре мерные колбы вместимостью 100  помещают 50 , 25 , 15 , 10  стандартного раствора углевода (4.1). Объем растворов доводят бидистиллированной водой до метки.

В.4.2.1 Все растворы готовят перед определением.

B.4.3 Подготовка подвижной фазы

Дегазацию растворенного в подвижной фазе воздуха проводят с помощью водоструйного или вакуумного насоса, обрабатывая бидистиллированную воду ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности, избегают вспенивания воды.

Подвижную фазу готовят в день определения.

B.4.4 Подготовка анализируемой пробы продукта

B.4.4.1 (1,000 0,001) г сухого продукта помещают в мерную колбу вместимостью 100 . Мерным цилиндром приливают 20  бидистиллированной воды и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и снова тщательно перемешивают. Затем центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин и фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.2 (10,0000,001) г сгущенного продукта помещают в мерную колбу вместимостью 100 . Мерным цилиндром приливают 20  бидистиллированной воды и перемешивают. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и снова тщательно перемешивают. Затем центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин и фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.3 Жидкую сыворотку помещают в центрифужные пробирки соответствующего объема и центрифугируют 10 мин со скоростью 15 об/мин в течение 5 мин. Затем фильтруют через нейлоновый фильтр.

B.4.4.4 Для анализа используют водную фракцию

B.4.5 Подготовка хроматографа

Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

B.4.5.1 Условия хроматографирования:

- скорость потока - (0,3 - 0,6) ;

- температура - 85,0°С;

- подвижная фаза: бидистиллированная вода;

- детектор: рефрактометрический.

B.4.5.2 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика измеряют площади пиков, соответствующие массовым долям углевода в градуировочных растворах. Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее трех раз. Измерения выполняют последовательно, начиная с растворов с наименьшей массовой концентрацией определяемого вещества.

Полученные при хроматографировании значения не должны отклоняться от стандартных не более, чем на 5,00%.

По полученным данным, используя программные обеспечения к приборам, рассчитывают коэффициенты регрессии а и b прямой .

Градуировочный график строят с учетом вычисленных значений уравнения:

,

(1)

где Y - площадь пика углевода;

а и b - коэффициенты регрессии;

- массовая доля углевода в градуировочном растворе, %.

В.4.5.3 Градуировку проводят не реже 1 раза в квартал, а также при использовании новой партии реактивов, замене колонок или ремонте хроматографа.

B.5 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

температура окружающего воздуха ..............(205)°С;

относительная влажность воздуха ..............(5525)%;

атмосферное давление .........................(9610) кПа;

частота переменного тока .....................(505) Гц;

напряжение в сети ............................(22010) В.

Для проведения измерений применяют бидистиллированную воду, которую готовят следующим образом: дистиллированную воду фильтруют через мембранный фильтр (размер диаметра пор не более 0,5 мкм), затем кипятят для удаления растворенного воздуха и охлаждают до комнатной температуры.

B.6 Проведение измерений

В.6.1 Дегазация анализируемой пробы

В мерную колбу вместимостью 50  помещают 3  фильтрата по 4.4. Дегазацию растворенного в фильтрате воздуха проводят с помощью вакуумного насоса, обрабатывая ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности, избегают вспенивания.

В.6.2 В инжектор хроматографа вводят от 0,02  тщательно отмеренного дегазированного фильтрата со скоростью потока (0,3 - 0,6) .

В.7 Обработка результатов измерений

В.7.1 Массовую долю лактозы в сухой пробе продукта , %, вычисляют по формуле

,

(2)

где

- объем анализируемой пробы после разбавления по 4.4, ;

X - массовая доля углевода, рассчитанная по градуировочному графику (4.5.2), %;

0,02 - объем анализируемой пробы, взятый для анализа по 6.2, .

7.2 Массовую долю лактозы в жидкой и концентрированной пробе , %, вычисляют по формуле

,

(3)

где - общий объем анализ