Приложение N 4. Дифференциация атипичных микобактерий

Приложение N 4
к Наставлению по диагностике
туберкулеза животных

1. Дифференциация атипичных микобактерий

1.1. При лабораторном исследовании материала от реагировавших на туберкулин животных могут быть выделены атипичные микобактерии, отличающиеся от микобактерий туберкулеза по ряду признаков. Для систематизации атипичных микобактерий пользуются группировкой Раньона, основанной, главным образом, на двух признаках: скорости роста на питательных средах и пигментообразовании, по которым их разделяют на 4 группы.

1 группа - фотохромогенные микобактерии. Вырастают в темноте (в термостате) в течение 15-30 дней. Бесцветны, но после освещения дневным или электрическим светом становятся желтыми или желто-оранжевыми. Такой же пигмент культуры приобретают, если во время роста, находились на свету. К ним относятся М. kansasii и М. marinum.

2 группа - скотохромогенные микобактерии. Образуют ярко-оранжевый пигмент независимо от того, выращивались ли они на свету или в темноте, растут медленно - 15-30 дней. К ним относятся М. gordonac, М. scrofulaceum, М. paraffinicum.

3 группа - нефотохромогенные микобактерии. Не образуют пигмента или имеют светло-кремовую или бледно-желтую окраску. К ним относятся М. intracellulare, М. xenopi, М. terrae, М. gastri, М. triviale.

4 группа - быстрорастущие микобактерии. Образуют пигментные или беспигментные колонии, чаще R-формы. Вырастают а течение 3-10 дней. К этой группе относятся М. fortuitum, М. chelonei, M. phlei, М. diernhoferi, М. thamnopheos, M. smegmatis, М. vaccae, М. flavescens, М. peregrinum.

1.2. Дифференциацию культур проводят в 1-ой адаптивной генерации. С целью получения единичных колоний и учета скорости роста при разных температурных режимах, а также характера роста на мясо-пептонном бульоне, с поверхности среды берут отдельную колонию (примерно 2-5 мг) испытуемой культуры микобактерий и помещают в стерильную пробирку с 1-2 мл физиологического раствора.

Взятую массу микобактерий растирают стеклянной палочкой по стенке пробирки и добавляют физиологический раствор до концентрации 1 мг/мл.

Взвесь культуры микобактерий высевают с помощью пипетки диаметром 3-4 мм пять пробирок со средой Левенштейна-Йенсена и в две пробирки с мясопептонным бульоном. Обе пробирки с МПБ и одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 37-38°С. По одной пробирке со средой Левенштейна-Йенсена инкубируют при 25 и 45°С. Две оставшиеся пробирки со средой Левенштейна-Йенсена, одну из которых завертывают в светонепроницаемую бумагу, а другую - подвергают освещению в течение 1 часа на расстоянии 1 м от источника света мощностью 100 Вт, ставят в термостат при 37-38°С для изучения пигментообразования.

Учет роста культур в первые 10 суток проводят один раз в 2-3 дня, в последующие три недели каждые пять дней. Учет пигментообразования проводят через 21 сутки после посева культур. При оценке регистрируют, на какой питательной среде и в какой срок появляются колонии бактерий, и какова их пигментированность.

Культуры, выросшие на среде Левенштейна-Йенсена до 7 суток, а также образовавшие в течение этого срока на мясопептонном бульоне кольцо или пленку, относят к 4 группе по Раньону (быстрорастущие). Культуры, выросшие в сроки свыше 7 суток, и образующие желтый, желто-оранжевый или красноватый пигмент на свету, при отсутствии его в завернутых пробирках, относят к 1 группе по Раньону (фотохромогенные).

Культуры, образующие пигмент на свету и при полном отсутствии света, относят ко 2 группе по Раньону (скотохромогенные).

Культуры, не образующие пигмента ни на свету ни в темноте, относят к 3 группе по Раньону (нефотохромогенные).

2. Выделение Л-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала

Исследование материала для выделения Л-форм микобактерий туберкулеза проводят при постановке первичного диагноза и в оздоравливаемых хозяйствах в случае выявления реагирующих на туберкулин животных при контрольных исследованиях.

2.1. Для изоляции Л-форм микобактерий используют тот же материал, что и для выделения бактериальных форм. Предпосевную обработку и посев материала осуществляют общепринятыми методами. Плотный осадок засевают вначале на яичные питательные среды, оставшуюся часть суспендируют в небольшом количестве физиологического раствора и пастеровской пипеткой засевают на среду Школьниковой-Дорожковой, состоящую из трех компонентов: среды Школьниковой, сахарозы и сыворотки крови.

2.1.1 Среда Школьниковой

Калий фосфорнокислый однозамещенный	- 1,5 г
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	- 2,5 г
Магний сернокислый	- 0,5 г
Натрий лимоннокислый	- 1,5 г
Железо аммиачное лимоннокислое (зеленое)	- 0,05 г
Аспарагин (если Д, то берется двойная доза)	- 1,0 г
Глицерин х.ч.	- 30 мл
Агар-агар	- 3,0 г
Вода дистиллированная	- 1 000 мл

Все ингредиенты в строгой последовательности (кроме агар-агара и глицерина) растворяют в 300 мл дистиллированной воды при легком подогревании на водяной бане. Каждый новый ингредиент вносят в среду только после полного растворения предыдущего. В остальном количестве воды (700 мл) расплавляют агар-агар. Затем солевой раствор смешивают с раствором агар-агара и в него добавляют необходимое количество глицерина. Полученную смесь пропускают через ватно-марлевый фильтр, тщательно промытый в дистиллированной воде, разливают в колбы по 400 мл и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 30 мин.

2.1.2. Сахароза. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 200 г химически чистой сахарозы. Раствор разливают в колбы по 50 мл и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин.

2.1.3. Нативная сыворотка крови крупного рогатого скота без консерванта. За два дня до посева 400 мл среды N 1 расплавляют на водяной бане, охлаждают до 45-50°С и в условиях стерильного бокса добавляют по 50 мл компонентов N 2 и N 3. Готовую среду разливают в пробирки по 5 мл и помещают в термостат при 37-38°С на двое суток для контроля на стерильность.

Пробирки с посевами на этой среде устанавливают в вертикальном положении.

2.2. Характеристика роста Л-форм микобактерий.

На плотных средах рост появляется через 3-4 недели. Для обнаружения роста поверхность сред просматривают с помощью оптических приборов, дающих увеличение в 6-10 раз. Для Л-форм характерен рост в виде гладких, влажных, мутноватых, очень мелких колоний до 0,1 мм в диаметре, находящихся в зоне нанесения материала. Л-колонии обнаруживаются как в чистом виде, так и в смеси с типичными формами.

На среде Школьниковой-Дорожковой рост колоний обнаруживается в те же сроки в виде нежного облачка от поверхности среды до глубины 2-3 см. Наличие грубого зернистого роста, а также роста на поверхности среды в виде приставочного кольца свидетельствует о наличии бактериальных форм микобактерий. Обильное помутнение среды, часто на всю глубину, свидетельствует о загрязнении посева посторонней микрофлорой.

2.3. Микроструктура Л-форм микобактерий

При обнаружении на питательных средах роста, характерного для Л-культур, готовят препараты для обычной и фазово-контрастной микроскопии. Препараты просматривают в иммерсионной системе.

В мазках окрашенных по Цилю-Нильсену обнаруживают гигантские шаровидные тела, однородные или крупнозернистые, окрашенные в буровато-красный цвет, до 60-100 мкм и более в диаметре. Иногда в мазках обнаруживают единичные, морфологически измененные кислотоустойчивые, как правило, с синими зернами, бактерии.

При фазово-контрастной микроскопии обнаруживают все структуры, характерные для Л-форм бактерий. Наиболее закономерным является наличие гетерогенной зернистой массы с включением в неё сферических тел различной величины и оптической плотности, а также отдельных гигантских шаровидных тел однородной или зернистой структуры с тонкой нежной оболочкой.

2.4. Установление принадлежности Л-структур к микобактериям

Доказательством принадлежности выросших Л-структур к микобактериям являются: сохранение жизнеспособности после специальной обработки кислотой; рост на специальных питательных средах; возможность реверсии в исходный микобактериальный вид.

Для реверсии Л-форм в исходный вид, выращенные колонии пересевают на среду Школьниковой-Дорожковой. На этой среде они реверсируют при первом-третьем пассажах, проводимых с интервалом от 10 дней до одного месяца. При отсутствии роста на яичных средах обращают внимание на рост Л-форм на среде Школьниковой-Дорожковой.

Культуры - ревертанты микобактерий изучают по общепринятой методике. Культурами Л-форм, не дающими реверсии, заражают морских свинок подкожно в дозе 0,5 мл. За свинками ведут наблюдение согласно соответствующему разделу настоящего наставления.

2.5. Ускоренный способ реверсии Л-форм микобактерий (по В.С. Федосееву с соавторами, 1969)

Для получения ускоренной реверсии используют 7-дневные куриные эмбрионы. Овоскопированием определяют место расположения зародыша. Затем, соблюдая правила асептики, заражают один эмбрион в желточный мешок Л-культурой. С помощью шприца набирают культуру со среды Школьниковой-Дорожковой. Скорлупу яйца над воздушным пространством обрабатывают спиртом, в центре прокалывают отверстие, через которое вводит культуру в дозе 0,1-0,2 мл в желточный мешок, расположенный с противоположной стороны от зародыша. Отверстие в скорлупе заливают парафином. Зараженные эмбрионы помешают в термостат с температурой 35-37°С и влажностью 60-65%.

По истечении одних суток отверстие над воздушной камерой вскрывают, пастеровской пипеткой набирают часть желтка для микроскопического исследования и высева на яичные питательные среды. Этим же материалом заражают свежие 7-дневные куриные эмбрионы в дозе 0,1-0,2 мл. Так продолжают до получения реверсии, которая наступает, начиная с 3-4 пассажа. Обнаруживают ее в окрашенных мазках, где выявляют кислотоустойчивые палочки. Типичные колонии возбудителя на яичных средах появляются на 12-14 сут, в зависимости от вида микобактерий.

Для определения вида микобактерий туберкулеза проводят постановку биопробы согласно разделу 6.5.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "разделу 6.4"