Приложение N 1. Изготовление мазков и методы окраски микобактерий

Приложение N 1
к Наставлению по диагностике
туберкулеза животных

I. Изготовление мазков и методы окраски микобактерий

1.1. Методика приготовления мазков из культур микобактерий.

Мазки готовят, используя чистые обезжиренные предметные стекла. В боксе, в строго стерильных условиях, над пламенем спиртовки, открывают пробирку и стерильной платиновой лопаткой осторожно снимают часть исследуемой колонии, наносят на предметное стекло, на которое предварительно была нанесена капля физиологического раствора. Мазок можно делать оттянутой запаянной пастеровской пипеткой. На предметном стекле колонию хорошо растирают до образования хорошей суспензии. Пробирку закрывают над пламенем спиртовки и обеззараживают платиновую лопатку вне пробирки. При этом рекомендуется нагревать лопатку с тыльной стороны, постепенно передвигая до кончика, для избежания разбрызгивания культуры во время прокаливания, пока не появится дым на кончике лопатки от оставшейся культуры, и только после этого накалять кончик лопатки. Пастеровские пипетки обеззараживают в банке с дезинфицирующими растворами или в физиологическом растворе, дистиллированной воде с последующим автоклавированием.

1.2. Окраска мазков по Цилю-Нильсену. На предварительно фиксированный над пламенем мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина Циля и нагревают (2-3 раза в течение 5 мин) до момента появления паров и не доводят краситель до кипения. Дают препарату остыть, удаляют бумагу. Мазок обесцвечивают 3%-ным раствором солянокислого спирта в течение 30 секунд до получения слабозаметного розоватого оттенка. После обесцвечивания препарат тщательно промывают водой и окрашивают метиленовой синькой Леффлера в течение 3-5 мин. Краску смывают, мазок промывают водой и высушивают.

1.2.1. Приготовление карболового раствора фуксина Циля: 1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и 0,5 мл глицерина, прибавляя небольшими порциями 10 мл этилового спирта. Затем при постоянном помешивании к смеси добавляют 100 мл дистиллированной воды. Раствор краски выдерживают в термостате 24 ч и в дальнейшем хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой. Перед употреблением раствор фильтруют через бумажный фильтр.

1.2.2. Приготовление 3%-ного солянокислого спирта: к 97 мл 96°-ного этилового спирта добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты.

1.2.3. Приготовление метиленовой синьки Леффлера: 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленовой сини (8-9 г кристаллической метиленовой сини в 100 мл этилового спирта) пропускают через бумажный фильтр, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора едкого калия (KOH) и разбавляют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив в течение длительного времени.