Приложение N 5 . Исследование проб объектов внешней среды на наличие микобактерий

Приложение N 5
к Наставлению по диагностике
туберкулеза животных

Исследование проб объектов внешней среды на наличие микобактерий

Исследования проводят для выявления источника сенсибилизации животных в хозяйствах, где выявлены атипичные микобактерии.

1. Отбор проб

Пробы сена, соломы, концентрированных кормов, торфа, почвы, опилок, воды, смывы с поверхности различных предметов помещают в стерильную посуду. В лабораторию направляют среднюю пробу массой до 200 г, которую составляют из хорошо перемешанных проб данной партии, емкости и т.п.

Пробы почвы (земли, навоза, торфа) берут на глубине до 15 см лопаткой в 3-5 местах по 50-100 г, из них составляют среднюю пробу, которую помещают в широкогорлую банку или полиэтиленовый пакет.

Первичные пробы грубых кормов (сена, соломы) берут из разных мест скирды (стога) при помощи ножниц и пинцета из расчета 1 проба массой не менее 40 г на 4 площади скирды,

Корнеплоды (клубнеплоды) в зависимости от величины отбирают из расчета 1-3 шт. на 4 площади бурта, отсека хранилища. С отобранных корнеплодов скальпелем срезают поверхностный слой в местах, где имеются остатки земли.

Пробы силоса, хранящегося в ямах, отбирают как и пробы почвы, а вынутого из траншеи - как пробы зеленой массы.

Пробы зернофуража берут из поверхностных слоев со стороны устья мешка (совочком, шпателем) и из нескольких мест с боков и снизу (металлическим щупом). Отобранную навеску (500-1000 г) помещают в стерильную банку (полиэтиленовый мешочек).

Первичные пробы фуража, хранящегося насыпью в закромах, открытых ларях, ящиках и пр., массой не менее 100 г отбирают из расчета 1 проба на 4 поверхности, но не менее 5 из каждого закрома, партии, как из поверхностных, так и из глубоких слоев корма, равномерно по всему объему.

Из брикетированного комбикорма вынимают отдельные, соприкасающиеся с тарой брикеты, срезают их поверхностный слой и помещают в стерильную банку.

При отборе проб травы её срезают ножницами или скальпелем и пинцетом помещают в стеклянные банки, которые плотно закрывают.

Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10-15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли с грузом. Объем каждой пробы - не менее 0,5 л, общий объем - не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют как пробы почвы.

Из шахтных колодцев пробы воды берут чистым ведром или другой посудой после перемешивания воды в колодце многократным погружением ведра. Из водопроводного крана набирают в стерильную посуду около 0,5 л воды, а затем в течение 5-10 мин спускают застоявшуюся в трубах воду. После этого край обжигают горящим спиртово-ватным тампоном, набирают в другую стерильную посуду еще около 0,5 л воды.

Первичные пробы торфа, опилок, навоза (100 г каждая) отбирают из расчета 1 проба на 4 поверхности, но не менее 5 проб для каждой партии. Первичные пробы берут из поверхностных и глубоких слоев торфа или опилок равномерно по всей площади.

Отбор проб торфа, хранящегося в мешках, проводят так же, как проб зернофуража. С открытых поверхностей различных предметов ухода за животными, стен, пола, кормушек животноводческих помещений делают соскобы, а из автопоилок пробы берут при помощи тампонов.

На всех пробах указывают наименование хозяйства (фермы), место и дату отбора. Пробы доставляют в лабораторию в день отбора, их исследование проводят не позднее чем через 3 сут после получения.

2. Обработка проб

Предварительную обработку проб из объектов внешней среды проводят по методу А.П. Аликаевой. Навеску исследуемого материала массой 5-10 г измельчают, помещают в ступку, заливают физиологическим раствором так, чтобы материал был покрыт раствором, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин. Затем массу пропускают через 2-слойный марлевый фильтр, фильтрат переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5-10 мл 4%-ного раствора едкого натрия, перемешивают и снова центрифугируют в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 5-10 мл 10%-ного раствора соляной кислоты, перемешивают и вновь центрифугируют при тех же параметрах. Надосадочную жидкость сливают, а из осадка делают посевы на яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2, не менее 5 пробирок каждой среды.

Смывы с различных предметов и сперму обрабатывают по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши.

Яйца перед исследованием инкубируют в термостате при 37-38°С в течение 2 сут, после чего содержимое обрабатывают по методу Гона-Левенштейна-Сумиоши.

Посевы, их дальнейшую обработку, инкубацию и изучение свойств выращенных микобактерий осуществляют по общепринятой методике.

3. Изучение сенсибилизирующих свойств атипичных микобактерий

Для подтверждения причины реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу хозяйствах изучают сенсибилизирующие свойства атипичных микобактерий, выделенных из послеубойного материала от крупного рогатого скота.

Культуру атипичных микобактерий вводят подкожно 2-м морским свинкам в дозе 1 мг/мл. Спустя 21-30 дней после введения культуры их исследуют симультанной аллергической пробой с КАМ. ППД - туберкулин для млекопитающих в дозе 25 ТЕ и КАМ в дозе 10 ЕД в объеме 0,1 мл физиологического раствора или растворителя вводят внутрикожно с левой и правой стороны в депиллированные участки кожи на боках животного. Реакцию учитывают через 24-48 ч. Положительная реакция проявляется гиперемией кожи и образованием припухлости диаметром 5 мм и более, иногда с некрозом в центре. Обнаружение реакции на один или оба препарата свидетельствует о сенсибилизирующих свойствах изучаемой культуры. После проведенного аллергического исследования животных убивают.