Приложение N 2. Приготовление и контроль качества питательных сред

Приложение N 2
к Наставлению по диагностике
туберкулеза животных

1. Приготовление и контроль качества питательных сред

1.1. Для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза используют яичные среды: Петраньяни, Гельберга, Левенштейна-Йенсена, Финн-2.

Яичные среды готовят только в стерильной посуде; добавление яичной массы, фильтрацию и разлив производят в боксе. Для приготовления яичных питательных сред используют только свежие куриные яйца со сроком хранения не более 5 сут. Яйца предварительно тщательно моют щеткой в теплой воде с мылом, смачивают спиртом и обжигают, затем разбивают стерильным пинцетом, выливают содержимое в стерильную банку (большую колбу) с бусами или битым стеклом и энергично встряхивают после внесения каждого яйца.

1.2. Среда Гельберга (ингредиенты и приготовление). Среда состоит из яичной массы, молока, картофельного отвара и солевого раствора.

Яйца цельные	- 6 шт.
Желтки	- 4 шт.
Молоко	- 100 мл
Картофельный отвар	- 100 мл
Солевой раствор	- 100 мл
Стерильный 2%-ный водный раствор малахитовой зелени	- 7,8 мл

Молоко, картофельный отвар и солевой раствор готовят заранее и хранят в холодильнике.

1.2.1. Приготовление молока. Молоко предварительно ставят на сутки в холодильник, снимают сливки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 110 мл в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром в аппарате Коха два дня подряд: в первый день - 15 мин, во второй - 10 мин (после стерилизации в колбе (во флаконе) остается 100 мл молока). Стерилизацию можно проводить в автоклаве, при этом температуру доводят до 120°С, после автоклав выключают.

1.2.2. Приготовление картофельного отвара. Картофель моют щеткой с мылом, промывают проточной водой, чистят, заливают двойным количеством водопроводной воды (на 1 кг картофеля 2 л воды), кипятят 15 мин, отстаивают и верхний слой фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Отвар разливают во флаконы по 110 мл и стерилизуют так же, как молоко.

Соли и пептон растворяют в небольшом количестве воды, добавляют глицерин и остальную воду. Раствор слегка подогревают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 110 мл и стерилизуют так же, как и картофельный отвар.

1.2.3. Приготовление солевого раствора.

Калий фосфорнокислый двузамещенный	1 г
Натрий лимоннокислый	1 г
Магний сернокислый	1 г
Пептон	6 г
Глицерин х.ч.	30 мл
Вода дистиллированная	до 1000 мл

1.2.4. Приготовление водного раствора малахитового зеленого. 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 120°С.

1.2.5. Приготовление среды. В банку с бусами и взбитыми яйцами добавляют по 100 мл молока, картофельного отвара, солевого раствора и 7,5 мл 2%-ного водного раствора малахитовой зелени. Смесь тщательно размешивают, разливают по пробиркам (4-5 мл в каждую), помещают в наклонном положении в свертыватель или аппарат Коха и стерилизуют в течение двух суток, первый день при 85°С, во второй - при 90°С в течение 30 мин.

1.3. Среда Петраньяни (ингредиенты и приготовление)

Молоко цельное	- 300 мл
Крахмал картофельный	-12 г
Пептон	- 2 г
Картофель очищенный, мелко нарезанный	- 2 клубня размером с яйцо

Ингредиенты тщательно смешивают в колбе и варят на слабом огне до образования клейстера. К охлажденной до 50°С смеси добавляют 8 цельных яиц и 2 желтка, 24 мл глицерина и 20 мл 2%-ного стерильного водного раствора малахитовой зелени. Хорошо смешивают, фильтруют через воронку с двойным слоем марли, разливают по пробиркам (4-5 мл в каждую) и стерилизуют, как указано в п. 1.2.5.

1.4. Среда Левенштейна-Йенсена (ингредиенты и приготовление)

1.4.1. Солевой раствор

Калий фосфорнокислый однозамещенный	- 2,4 г
Магний сернокислый	- 0,34 г
Магний лимоннокислый	- 0,6 г
Аспарагин	- 3,6 г
Глицерин х.ч.	- 12 мл
Вода дистиллированная	до 600 мл

Соли растворяют в указанной последовательности, раствор стерилизуют 2 часа текучим паром или в автоклаве в течение 15 мин при температуре 120°С.

1.4.2. Яичная масса. Приготавливают 1 000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Для этого яйца, вымытые в проточной воде с мылом, в количестве 20-25 штук кладут в 70%-ный спирт на срок не менее 1 часа, затем разбивают в стерильную круглодонную колбу с бусами (из каждого десятка яиц отбрасывают два белка), хорошо размешивают и фильтруют через стерильную марлю.

1.4.3. Водный 2%-ный раствор малахитовой зелени. 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 120°С.

1.4.4. Приготовления среды. В колбу, содержащую 30 г картофельного крахмала, добавляют 600 мл солевого раствора, смесь нагревают, постоянно взбалтывая, на кипящей бане до вязкой консистенции. К охлажденной (до 45-60°С) смеси добавляют 1 л яичной массы и 20 мл 2%-ного водного раствора малахитовой зелени, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл и стерилизуют как указано в пункте 1.2.5.

1.5. Среда Финна-2 (ингредиенты и приготовление)

1.5.1. Солевая основа:

Магний сернокислый	- 0,5 г
Натрий лимоннокислый	- 1,0 г
Квасцы железоаммиачные	- 0,05 г
Калий фосфорнокислый однозамещенный	- 20,0 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный	- 5,0 г
Натрий глутаминовокислый однозамещенный	- 10,0 г
Глицерин х.ч.	- 20 мл
Вода дистиллированная	- до 1 000 мл

Ингредиенты растворяют в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде (рН не корректировать - 6,3-6,5). Раствор стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.

1.5.2. Приготовление яичной массы. 40 цельных яиц моют щеткой в теплой воде с мылом, обрабатывают спиртом, затем разбивают пинцетам и выливают в стерильную колбу с бусами, которую после добавления каждого яйца встряхивают до образования однородной массы.

1.5.3. Водный 2%-ный раствор малахитовой зелени. 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 мин.

1.5.4. Приготовление среды. К яичной массе добавляет 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1 л солевого раствора. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл и свертывают при температуре 85°С в течение 30 мин.

1.6. Яичная среда с салицилатом натрия.

Для приготовления питательной среды с салицилатом натрия используют яичные среды, указанные выше (лучше среду Левенштейна-Йенсена). В начале готовят раствор салицилата натрия из расчета содержания 100 000 мкг салицилата в 1 мл раствора. В этих целях 500 мг вещества растворяют в 5 мл стерильной дистиллированной воды. Затем в приготовленную яичную среду (перед разливом ее в пробирки) вносят 1 мл раствора салицилата натрия на каждые 100 мл среды, смесь хорошо смешивают, фильтруют и разливают по пробиркам.

1.7. Среда ФАСТ-ЗЛ. Во флакон с лиофилизированной средой ФАСТ-ЗЛ вливают 58,3 мл стерильной дистиллированной воды с рН 6,0; энергично встряхивают и помещают в термостат с температурой нагрева 37-38°С на 30 мин с периодическим встряхиванием. Лиофилизированная среда должна полностью раствориться и представлять собой однородную жидкость светло-зеленого цвета консистенции молока.

После растворения сухой среды (30-40 мин) её разливают при периодическом встряхивании флакона в стерильные бактериологические пробирки по 5 мл и укупоривают стерильными ватно-марлевыми пробками.

Пробирки в наклонном положении помещают в аппарат Коха с температурой нагрева 85°С на 30 мин для свертывания среды. Затем пробирки в том же положении выдерживают в термостате при температуре 37-38°С в течение 18-20 часов и повторно прогревают при температуре 85°С в течение 20 мин.

1.8. Все яичные среды, приготовленные по указанным прописям, разливают в пробирки по 4-5 мл с помощью большой стерильной воронки, снабженной резиновой трубкой с зажимом и стеклянным наконечником. Затем пробирки со средами стерилизуют.

После стерилизации в пробирках должно оставаться небольшое количество конденсационной жидкости, если же её нет, то необходимо добавить в каждую пробирку (в боксе при соблюдении правил стерильности) 0,5-1 мл стерильного физиологического раствора или солевого раствора среды Гельберга, или среды Левенштейна-Йенсена.

Для контроля стерильности пробирки со средами помещают в термостат с температурой 37-38°С на 2-3 сут. На средах не должно быть роста никакой микрофлоры.

При посевах и пересевах материала и культур применяют свежие среды (2-3-недельной давности), но при условии хранения питательной среды в холодильнике в туго завязанных целлофановых пакетах ею можно пользоваться в сроки до 3 месяцев.

Для ускорения роста микобактерий на поверхность питательных сред за 1-2 сут до посевов рекомендуется наносить смесь нормальных алканов (из расчета 1 капля на 4 мл среды), т.е. жидких фракций углеводородов с содержанием молекул углерода от до .