Приложение А (справочное). Методы хроматографического анализа

Приложение А
(справочное)

Методы хроматографического анализа

А.1 Предварительное замечание

Поскольку оснащение (см. 6.9) лабораторий может быть различным, для хроматографических анализов невозможно представить общие инструкции. Успешно испытываются и используются следующие параметры.

А.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (количественный метод)

А.2.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография/фотометрический детектор с диодной матрицей (ВЭЖХ/ФДМД)

Элюент 1.........................метанол;

Элюент 2.........................0,575 г дигидрофосфата аммония + 0,7 г

                                 гидрофосфата натрия в 1 000 мл воды,

                                 уровень рН = 6,9;

Неподвижная фаза.................Zorbax SB-Phenyl* (5 мкм);

                                 (250x4,6) мм;

Скорость потока..................от 0,7 до 1,0 мл/мин;

Градиент ........................см. таблицу А.1;

Таблица А.1 - Программа градиента

Время, мин	Элюент 1, %	Элюент 2, %
0	0	100
5	10	90
10	10	90
27	68	32
29	100	0

Температура колонки..............30°С;

Вводимый объем пробы.............10,0 мкл;

Детектирование...................ФДМД, спектрограф;

Количественный анализ............при 240, 280, 305 и 380 нм.

А.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография/масс-селективный детектор (ВЭЖХ/ФДМД/МСД)

Элюент...........................ацетонитрил;

Элюент 2.........................ацетат аммония в 1000 мл воды, 5 ммоль,

                                 уровень рН = 3,0;

Неподвижная фаза ................Zorbax Eclipse XDB C18** (3,5 мкм);

                                (50x2,1) мм;

Скорость потока .................300 мкл/мин;

Градиент ........................см. таблицу А.2;

Таблица А.2 - Программа градиента

Время, мин	Элюент 1, %	Элюент 2, %
0	10	90
1,5	20	80
7,5	90	10

Температура колонки..............40°С;

Вводимый объем ..................2,0 мкл;

Обнаружение .....................квадрупольная и/или масс-

                                 спектрометрическая ионная ловушка, режим

                                 сканирования и/или МС детектирование

                                 МС-дочернего иона; ФДМД: в отношении

                                 длины волны см. А.2.1;

Газ-спрей .......................азот (в сосудах/генераторный);

Ионизация .......................электрораспыление, положительное, по

                                 API, фрагментор 120 В.

А.3 Капиллярная газовая хроматография (КГХ/МСД) (количественный метод)

Капиллярная колонка .............ZB-5-(Zebron)***, длина 30 м, внутренний

                                 диаметр 0,25 мм, толщина пленки

                                 0,25 мкм;

Система ввода ...................без деления;

Температура инжектора ...........250°С;

Газ-носитель ....................гелий;

Температурная программа .........50°С(3 мин), от 50°С до 280°С(15°С/мин),

                                 280°С (6 мин);

Вводимый объем ..................1,0 мкл, деление 1:15;

Детектирование ..................МС.

А.4 Капиллярный электрофорез (КЭ/ФДМД) (количественный метод)

200 мкл раствора образца (см. 9.3) смешивают с 50 мкл HCl (с = 0,01 моль/л) и пропускают через мембранный фильтр (0,2 мкм). Этот раствор анализируют с помощью капиллярного зонального электрофореза.

Капилляр ........................1 56 см, без покрытия, внутренний

                                 диаметр 50 мкм, с увеличенной

                                 толщиной светопоглощающего слоя;

Капилляр 2 ......................56 см, покрытый поливиниловым спиртом

                                 (ПВС), внутренний диаметр 50 мкм,

                                 с увеличенной толщиной светопоглощающего

                                 слоя;

Буферный раствор.................фосфатный буферный раствор

                                 (с = 50 ммоль/л), уровень рН = 2,5;

Температура колонки ..............25°С;

Напряжение .......................30 кВ;

Время ввода ......................4 с;

Время продувки ...................5 с;

Детектирование ...................ФДМД 214, 254 нм, спектрограф.

А.5 Тонкослойная хроматография (ТСХ) (количественный метод); ВЭТСХ или ТСХ только для полуколичественного подтверждения

А.5.1

Пластины (ВЭТСХ): силикагель 60 с флуоресцентным индикатором F254, (2010) см.

Применяемый объем: (2 - 5) мкл, наносится в виде капли.

Подвижный растворитель 1: хлороформ/уксусная кислота (90 + 10) частей на объем.

А.5.2

Пластины (ТСХ): силикагель 60 с флуоресцентным индикатором F254, (2020) см.

Применяемый объем: 10,0 мкл, наносится в виде линии.

Подвижный растворитель 2: хлороформ/этилацетат/уксусная кислота (60 + 30 + 10) частей на объем.

Подвижный растворитель 3: хлороформ /метанол (95 + 5) частей на объем.

Подвижные растворители 2 и 3: один за другим без просушивания пластин.

А.5.3

Детектирование: 1) ультрафиолетовая (УФ) лампа;

                2) после последовательной обработки реактивами 1 и 2,

                время реакции приблизительно 5 мин.

Реактив 1:0,1%   в HCl (с = 1 моль/л).

Реактив 2: 0,2%  -нафтол в KОН (с = 1 моль/л).

А.6 Примеры хроматограмм и спектров

Примеры хроматограмм и спектров показаны на рисунках А.1 - А.4.

Рисунок А.1 - Хроматограмма общего ионного тока, 4-аминоазобензол, КГХ/МСД

Рисунок А.2 - КГХ/МСД 70 эВ-спектр и структура 4-аминоазобензола

Рисунок А.3 - Хроматограмма 4-аминоазобензола, ВЭЖХ/ФДМД; детектирование при 240 и 380 нм

Рисунок А.4 - ВЭЖХ/ФДМД-спектр 4-аминоазобензола

____________________________________________________

* Zorbax SB-Phenyl является примером подходящей продукции, имеющейся в продаже. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не указывает на предпочтение данного продукта со стороны ИСО.

** Zorbax Eclipse XDB С 18 является примером подходящей продукции, имеющейся в продаже. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователей настоящего стандарта и не указывает на предпочтение данного продукта со стороны ИСО.

*** ZB-5-(Zebron) является примером подходящей продукции, имеющейся в продаже. Эта информация приведена исключительно для удобства пользователей данного документа и не указывает на предпочтение данного продукта со стороны ИСО.