Кодекс Алиментариус. Руководство по использованию масс-спектрометрии (МС) для идентификации, подтверждения и количественного определения остатков (CAC/GL 56-2005)

Кодекс Алиментариус

Руководство по использованию масс-спектрометрии (МС) для идентификации, подтверждения и количественного определения остатков
(CAC/GL 56-2005)*(1)

ГАРАНТ:

См. перечень международных пищевых стандартов (Кодекс Алиментариус)

Контрольные испытания

При проведении анализа в целях мониторинга или контроля реализации особенно важно сгенерировать подтверждающие данные до предоставления информации о пробах, содержащих остатки пестицидов, которые, как правило, не связаны с товаром, либо в случае превышения максимально допустимых остаточных уровней (MRL). Пробы могут содержать интерферирующие химические вещества, которые ошибочно могут быть приняты за пестициды. Примерами в газовой хроматографии являются реакции детекторов захвата электронов на фталевые эфиры, а также реакции фосфор-селективных детекторов на соединения, содержащие серу и азот.

Анализ остатков пестицидов с помощью методов множественных остатков, как правило, состоит из двух фаз: отсев и подтверждение. Процесс схематично представлен на рисунке 2. Первая фаза охватывает выявление тех остатков пестицидов, которые с наибольшей долей вероятности будут присутствовать по результатам толкования первичной информации при недопущении ложноотрицательных значений, насколько это возможно. Вторая фаза представляет собой подтверждение, которое ориентировано на пестициды, обнаруженные в рамках фазы 1. Применение результатов, о которых необходимо сообщать, а также последующие управленческие решения определяют усилия, вкладываемые в процесс подтверждения. Выбор методов подтверждения зависит от их доступности, времени и стоимости. Они основаны на дальнейшем толковании данных хроматографии и масс-спектрометрии, на альтернативных методах, использующих различные физико-химические свойства соединений, либо на сочетании различных методов отделения и обнаружения. Некоторые альтернативные процедуры подтверждения представлены в Таблице 6.

При применении хроматографических методов в процессе отсева или подтверждения ключевой является надлежащая установка временного интервала удерживания. Следует обращать внимание на то, чтобы инструмент был правильно отрегулирован до начала анализа; испытания пригодности системы должны проводиться перед анализом каждой серии*(2). База данных о времени удерживания должна быть скорректирована в соответствии с текущими условиями*(3). В рамках фазы 1 интервалы допуска, равные 1,5 - 3% абсолютного времени удерживания, могут применяться к капиллярной газовой хроматографии в зависимости от формы пиков. В целях подтверждения времени удерживания абсолютные интервалы допуска будут увеличиваться при большем времени удерживания. Интервал допуска должен быть меньше 1 секунды для времени удерживания менее 500 секунд. Для времени удерживания от 500 до 5 000 секунд рекомендуется интервал, равный 0,2% от относительного времени удерживания (RRT). Для более длительного времени удерживания рекомендуется интервал, равный 6 секундам.

Контрольные испытания могут быть количественными и/или качественными, но в большинстве случаев потребуются оба вида информации. Конкретные проблемы возникают, когда остатки должны быть подтверждены на уровне или около уровня предела квантификации, хотя на данном уровне сложно определить количество остатков. Важно обеспечить надлежащее подтверждение уровня и идентичности.

Необходимость проведения контрольных испытаний может зависеть от типа пробы или от ее известной истории. В некоторых видах урожая или продуктов зачастую можно обнаружить определенные остатки. Что касается ряда проб одинакового происхождения, которые содержат остатки одних и тех же пестицидов, может быть достаточным подтверждение идентичности остатков в небольшой части случайно отобранных проб. Аналогичным образом, если известно, что определенный пестицид применялся в отношении пробного материала, подтверждение идентичности может не требоваться, однако количество случайно отобранных результатов должно быть подтверждено. При наличии "пустых" проб они должны применяться для проверки наличия потенциальных интерферирующих веществ.

Необходимые меры для положительной идентификации определяются на усмотрение аналитика. Особое внимание следует уделять выбору метода, который позволит минимизировать воздействие интерферирующих соединений.

Выбранный(-ые) метод(-ы) зависит(-ят) от наличия подходящих инструментов и опыта испытательной лаборатории.

Газовая спектрометрия/масс-спектрометрия (GC/MS)

Данные об остатках, полученные с использованием масс-спектрометрии, являются окончательным доказательством и, при наличии надлежащих инструментов, предпочтительным методом подтверждения. Данный метод также используется главным образом в целях отсева остатков (фаза 1). Определение остатков в рамках масс-спектрометрии, как правило, проводится в сочетании с методом хроматографического отделения, чтобы одновременно предоставить данные о времени удерживания, соотношении массы иона к заряду, а также данные о концентрации. Количественная передача изменчивого аналита в рамках хроматографической системы испытывает на себе те же трудности, что и другие детекторы. В целях определения количества необходимо контролировать ионы, которые наиболее характерны для аналита, наименее подвержены интерференции и обеспечивают хорошее соотношение сигнала-шума.

При использовании контроля заданных ионов (SIM) на данном этапе должны быть установлены интервалы допуска ионных соотношений и времени удерживания, основанные на введении стандартных пестицидов в чистый растворитель в концентрациях, близких к критическим уровням. Интервалы допуска для ионных соотношений должны лежать в пределах 30% от абсолютных соотношений распространенности ионов. Если 2 (или 3) соотношения заданных ионов находятся в пределах установленных интервалов допуска, остаток подтвержден*(4). Для незначительного количества пестицидов масс-спектр может состоять только из одного конкретного иона. В этом случае необходимо альтернативное подтверждение.

Если обнаруженные ионы по-прежнему указывают на возможное наличие остатков, результаты могут быть представлены как предварительно идентифицированные. Однако в тех случаях, когда результаты потребуют принятия регулятивных мер или будут использованы для других целей (например, для оценки пищевого рациона), требуется дополнительное подтверждение идентичности аналита. Этого можно достичь посредством тех же инструментов GC-MS путем ввода стандартов исследуемого вещества с согласованной матрицей, чтобы компенсировать влияние матрицы на соотношение ионов. В данном случае необходим последующий ввод стандартов с согласованной матрицей и исследуемого образца. Отклонение RRT аналита для стандарта и исследуемого пика для пробы, как правило, должно составлять менее 0,1%. Два соотношения ионов, измеренные в пробе, должны находиться в пределах интервала допуска, рассчитанного на основе соотношений ионов в стандарте с согласованной матрицей. Остаток считается подтвержденным, если он соответствует указанному выше общему правилу. Если соотношения ионов выходят за пределы интервалов допуска, дополнительное подтверждение идентичности может быть проведено посредством применения альтернативных аналитических методов. Примеры представлены в Таблице 6.

Дополнительное подтверждение с помощью масс-спектрометрии можно осуществлять посредством захвата полного масс-спектра электронного удара (на практике, как правило, от удельного заряда (m/z) 50 до выхода за пределы молекулярной ионной области). Отсутствие интерферирующих ионов является важным фактором при подтверждении идентичности. Дополнительное подтверждение идентичности может быть достигнуто путем (i) применения альтернативной хроматографической колонки; (ii) применения альтернативного метода ионизации (например, химической ионизации); (iii) мониторинга дополнительных продуктов реакции заданных ионов посредством тандемной масс-спектрометрии (MS/MS или ); или (iv) мониторинга заданных ионов при повышенной разрешающей способности масс-спектрометра.

Определения масс-спектрометрии должны удовлетворять аналитическим критериям контроля качества, аналогичных тем, что применяются в отношении других систем.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) и высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (HPLC-MS)

Подтверждение остатков, выявленных в результате разделения методом HPLC, как правило, более затруднительно в сравнении с применением газовой хроматографии. Если обнаружение осуществляется с помощью поглощения ультрафиолетовых лучей, образование полного спектра может стать надлежащим свидетельством идентичности. Однако ультрафиолетовые спектры некоторых пестицидов слабо поддаются диагностике, так как они похожи на спектры многих других соединений, обладающих аналогичными функциональными группами или структурами, и коэлюция интерферирующих соединений может стать причиной дополнительных трудностей. Данные поглощения ультрафиолетовых лучей, полученные на кратной длине волн, могут подтвердить или опровергнуть идентификацию, но, как правило, сами по себе они не являются достаточной характеристикой. Флуоресцентные данные могут быть использованы для подтверждения данных, полученных путем поглощения ультрафиолетовых лучей.

Жидкостная хроматография с масс-спектрометрией (LC-MS) может предоставить надлежащие подтверждения, однако в силу того, что образуемые спектры, как правило, очень простые и демонстрируют незначительную характерную фрагментацию, результаты, полученные методом LC-MS, скорее всего, не будут окончательными. LC-MS/MS является более эффективным методом, сочетая в себе избирательность и специфику, и зачастую дает надлежащее подтверждение идентичности. Методы LC-MS подвержены влиянию матрицы, особенно подавлению, вследствие чего подтверждение количества может потребовать использования стандартного добавления или изотопно-меченых стандартов. Дериватизация также может применяться в целях подтверждения остатков, обнаруженных посредством HPLC (Таблица 6).

Тонкослойная хроматография (TLC)

В некоторых случаях подтверждение результатов газовой хроматографии с наибольшей легкостью достигается посредством TLC. Идентификация основана на двух критериях: значении коэффициента удерживания (Rf) и реакции визуализации. Методы обнаружения на основе биопроб (например, ферменты, рост грибов, ингибирование хлоропласта) особенно подходят для качественного подтверждения, так как они являются специфичными для определенного вида соединений, чувствительными и, как правило, находятся под незначительным влиянием совместных экстрактов*(5), *(6). Научная литература содержит многочисленные отсылки к методам*(7). Однако количественные аспекты тонкослойной хроматографии ограничены. Дальнейшее развитие данного метода предполагает удаление области на чаше, которая соответствует Rf соответствующего соединения, с последующим высвобождением слоистого материала и дальнейшим химическим или физическим подтверждающим анализом. Раствор стандартных пестицидов должен быть нанесен на чашу вместе с пробой экстракта, чтобы избежать проблемы невоспроизводимости Rf. Излишнее нанесение экстракта также может дать полезную информацию. Преимуществами тонкослойной хроматографии являются скорость, низкая стоимость и возможность ее применения к термочувствительным материалам. К недостаткам относятся (как правило) низкая чувствительность и разделительная способность по сравнению с инструментальными хроматографическими методами обнаружения, а также необходимость более тщательной очистки в случае обнаружения на основе цветных реакций химических веществ.

Дериватизация

При выборе ионов для GC/MS подтверждения на основе дериватов заданные ионы должны быть структурно значимыми для остатка и не должны представлять собой фрагменты дериватизирующего агента. Хотя дериватизация может быть значимым методом подтверждения идентичности остатка, следует принимать во внимание, что она станет дополнительным элементом в неопределенности количественного подтверждения.

Данную область подтверждения можно рассмотреть в рамках трех крупных категорий.

(а) Химические реакции

Зачастую применяются незначительные химические реакции, приводящие к деградации, добавлению или конденсации продуктов пестицидов с последующим повторным анализом продуктов методами хроматографии. В результате реакций образуются продукты с различным временем удерживания и/или откликами детектора от исходного соединения. Проба стандартного пестицида должна рассматриваться наряду с исследуемым остатком, чтобы результаты можно было непосредственно сравнивать. Обогащенный экстракт также должен быть включен, чтобы подтвердить наличие реакции при введении пробного материала. Если обнаружение дериватов осуществляется с помощью свойств дериватизирующего агента, может иметь место интерференция. Обзор химических реакций, которые использовались в целях подтверждения, был опубликован Кохрейном У.П. (Химическая дериватизация при анализе пестицидов, Plenum Press, NY (1981)). Преимущество химических реакций состоит в их быстроте и легкости проведения. Однако может потребоваться приобретение и/или очистка специальных реагентов.

(b) Физические реакции

Полезным методом является фотохимическое изменение остатков пестицидов в целях получения одного или нескольких продуктов с воспроизводимой хроматографической моделью. Проба стандартного пестицида и обогащенный экстракт должны обрабатываться одинаково. Пробы, содержащие несколько остатков пестицидов, могут стать причиной проблем интерпретации результатов. В таких случаях перед проведением реакции можно осуществить предварительное отделение определенных остатков с помощью TLC, HPLC или фракционирования на колонке.

(c) Иные методы

Многие пестициды подвержены деградации/трансформации с помощью ферментов. В отличие от нормальных химических реакций такие процессы имеют специфический характер и, как правило, включают в себя окисление, гидролиз или деалкилирование. Продукты переработки обладают различными хроматографическими характеристиками от исходных пестицидов и могут использоваться в целях подтверждения при сравнении с продуктами реакций, использующих стандартные пестициды.

Таблица 6 Методы обнаружения, пригодные для отсева (Фаза 1) и подтверждения (Фаза 2) остатков

		Фаза 1 - Отсев
		GC с капиллярной колонкой - ECD, NPD, FPD, PFPD	GC-MS	LC-MS	LC-DAD или сканирование УФ излучения	LC-УФ/Видимая область спектра (одночастотная)	LC-флуоресценция	GC с наполненной колонкой - ECD, NPD, FPD	TLC - ферменты, рост грибов или ингибирование хлоропласта
Фаза 2 - Подтверждение	GC - капиллярная колонка - детектор электронного захвата (ECD), азотно-фосфорный детектор (NPD), пламенно-фотометрический детектор (FPD), импульсный пламенно-фотометрический детектор (PFPD)	Х(1)	Х(1)	Х	Х	Х	Х	Х	Х
	GC-MS	Х(1)	Х(1), (2)	Х	Х	Х	Х	Х	Х
	LC-MS	Х	Х		Х	Х	Х	Х	Х
	Методы полного сканирования	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х
	, масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS), альтернативные методы ионизации	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х
	LC-DAD или сканирование УФ излучения	Х	Х	Х		Х	Х	Х	Х
	LC-УФ/Видимая область спектра (одночастотная)	Х	Х				Х	Х	Х
	LC-флуоресценция	Х	Х		Х	Х		Х	Х
	TLC - ферменты, рост грибов или ингибирование хлоропласта	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х(2), (3)
	Дериватизация	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х
	Конкретные профили изомеров	Х	Х	Х	Х	Х	Х	Х

(1) - Следует использовать либо колонку другой полярности, что приводит к иному порядку элюирования остатков и загрязняющих веществ, которые элюируются вблизи исследуемого пика, либо иной конкретный детектор.

(2) - Один и тот же метод GC-MS может применяться в рамках фазы 2 (подтверждение), если заданы иные ионы или установлены иные интервалы допуска на основе растворов с согласованной матрицей.

(3) - Следует использовать подвижную или неподвижную фазу другой полярности.

Рисунок 2. Схематическое представление отсева и подтверждения (Фаза 1 и Фаза 2) для остатков пестицидов

1 - Необычные значения, в том числе запрещенные вещества, нарушения MRL или требования исследования, как, например, при оценке воздействия

2 - См. таблицу 6 в отношении иных средств подтверждения

3 - Для небольшого количества пестицидов масс-спектр может состоять только из одного конкретного иона. В этом случае необходимо альтернативное подтверждение

------------------------------

*(1) GUIDELINES ON THE USE OF MASS SPECTROMETRY (MS) FOR IDENTIFICATION, CONFIRMATION AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF RESIDUES CAC/GL 56-2005. Принято в 2005 г.

*(2) Соболева Е., Амбрус А. Применение испытаний пригодности системы для обеспечения качества и оптимизации рабочих характеристик системы газовой хроматографии в целях анализа остатков пестицидов. J. Chromatogr. A. 1027. 2004. 55 - 65.

*(3) Лантос Дж., Каденцки Л., Закар Ф., Амбрус А. Валидация баз данных газовой хроматографии для количественной идентификации активных ингредиентов остатков пестицидов в: Файгель А., Амбрус А. (ред.) Принципы методов валидации, Королевское общество химии, Кембридж, 2000, стр. 128 - 137.

*(4) Соболева Е., Ахад К., Амбрус А. Применение некоторых критериев MS для подтверждения остатков пестицидов. Analyst, 129, 1123-1129, 2004.

*(5) Амбрус(1)* А., Фюцези(2) И.; Сюзан(2) M.; Доби(3) Д., Лантос(4) Дж., Закар(5) Ф., Корсос(4) И., Олах(3) Дж., Беке(3) Б.Б., и Л. Катавич(5) Экономичный метод отсева для анализа остатков пестицидов во фруктах, овощах и злаковых зернах, J. Environ Sci. Health B40, 297 - 339, 2005.

*(6) Амбрус А., Фюцези И.; Лантос Дж., Корсос И.; Хатфалуди Т. Повторяемость и воспроизводимость значений Rf и MDQ в различных системах высвобождения и обнаружения ТХ. J. Environ Sci. Health B39 2004 принято к публикации.

*(7) Международный союз теоретической и прикладной химии (IUPAC) Отчет о пестицидах (13) (Батора В., Виторович С.Й., Тьер Х.-П. и Клисенко M.A.; Pure & Appl. Chem., 53, 1981, 1039 - 1049.