Приложение Б (рекомендуемое). Методика определения массовой доли сахарозы, лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Приложение Б
(рекомендуемое)

Методика
определения массовой доли сахарозы, лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Диапазон измерений массовой доли сахарозы в продуктах от 20,0% до 60,0%, диапазон измерений массовой доли лактозы в продуктах от 0,5% до 20,0%.

Б.1 Сущность метода

Метод основан на определении сахарозы, лактозы в фильтрате, полученном после удаления из пробы жира и белка, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии при разделении на аминопропильной колонке. Полученные результаты измерения сравнивают со значениями массовой доли сахарозы, лактозы в стандартном образце.

Б.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

Хроматограф жидкостный высокоэффективный, включающий следующие элементы:

- колонку с привитой аминопропильной фазой, длиной 250 мм и размером внутреннего диаметра 4,6 мм, зернением 3 мкм;

- детектор высокочувствительный рефрактометрический с порогом шума не более единиц рефракции;

- насос с пульсацией не более 1% при давлении на колонку от 1,5 до 4,0 МПа;

- термостат для хроматографических колонок, обеспечивающий поддержание температуры (25 2)°С;

- устройство петлевое для ввода пробы рабочим объемом петли 0,020 ;

- программное обеспечение по управлению хроматографом и обработке хроматографических данных.

Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 или весы по нормативным документам, действующим на территории государств, принявших стандарт с пределами допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания 0,001 г.

Дозаторы пипеточные переменного объема дозирования в диапазоне 0,040 - 1,000 .

Микрошприц для ВЭЖХ вместимостью 0,100 .

Часы электронно-механические по ГОСТ 27752.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Баня ультразвуковая лабораторная рабочим объемом не менее 2 .

Колбы мерные 1-100-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Пипетки с одним делением 1(2)-2-5, 1(2)-2-10, 2-2-20 по ГОСТ 29169.

Воронки В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.

Насос водоструйный лабораторный по ГОСТ 25336.

Прибор для фильтрования стеклянный с фильтром с размером диаметра 0,45 мкм.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, фильтры с размером диаметра 12,5 см.

Фильтр нейлоновый с размером пор 0,45 мкм.

Образец стандартный лактозы, массовой долей основного вещества не менее 99,0%.

Образец стандартный сахарозы, массовой долей основного вещества не менее 99,0%.

Калий железистосинеродистый по ГОСТ 4207, х.ч.

Кислота уксусная по ГОСТ 61.

Цинк уксуснокислый по ГОСТ 5823, ч.д.

Ацетонитрил, ч.д.а.

Вода для лабораторного анализа первой степени чистоты (бидистиллированная) по действующей нормативной документации.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

Б.3 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26809.1.

Б.4 Подготовка к проведению измерений

Б.4.1 Подготовка стандартного раствора углеводов

В мерную колбу вместимостью 100  помещают 1 г стандартного образца лактозы с записью результата до третьего знака после запятой и 2 г стандартного образца сахарозы с записью результата до третьего знака после запятой, растворяют в небольшом количестве бидистиллированной воды. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при температуре от 4°С до 6°С - не более 7 сут.

Б.4.2 Приготовление реактивов для осаждения жировой фракции и белка (Каррезо 1 и Каррезо 2)

Б.4.2.1 Приготовление реактива Каррезо 1

В мерную колбу на 1000  помещают 106 г железистосинеродистого калия с записью результата до четвертого знака после запятой, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора в темной посуде - не более 1 мес.

Б.4.2.2 Приготовление реактива Каррезо 2

В мерную колбу на 1000  помещают 220 г уксуснокислого цинка с записью результата до четвертого знака после запятой, и аккуратно в эту же колбу вносят 30  ледяной уксусной кислоты, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки.

Срок хранения раствора при комнатной температуре - не более 1 мес.

Б.4.3 Подготовка подвижной фазы

Подвижную фазу - ацетонитрил/вода готовят в соотношении 75/25 по объему.

Дегазацию растворенного в подвижной фазе воздуха проводят с помощью водоструйного или вакуумного насоса, обрабатывая ультразвуком в течение 30 с при комнатной температуре. По возможности, избегают вспенивания.

Подвижную фазу готовят в день определения.

Б.4.4 Подготовка анализируемой пробы продуктов

В мерную колбу вместимостью 100  помещают (5,000 0,001) г продуктов. Мерным цилиндром приливают 20  бидистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют 1  раствора Каррезо 1 и 1  раствора Каррезо 2. Объем раствора доводят бидистиллированной водой до метки и снова тщательно перемешивают, оставляют в покое на 15 мин. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Отбирают 1  полученного фильтрата и фильтруют через нейлоновый фильтр.

Полученный фильтрат используют для хроматографического анализа.

Б.4.5 Подготовка хроматографа

Установку, включение и подготовку хроматографа к работе выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.

Б.4.5.1 Условия хроматографирования:

- скорость потока - 1,0 /мин;

- температура - 25,0°С;

- подвижная фаза: ацетонитрил/вода (75/25);

- детектор: рефрактометрический.

Б.5 Условия проведения измерений

При выполнении измерений в лаборатории должны соблюдаться следующие условия:

- температура окружающего воздуха ....................................(20 5)°С;

- относительная влажность воздуха ......................................(55 25)%;

- атмосферное давление ......................................................(96 10) кПа;

- частота переменного тока ...................................................(50 5) Гц;

- напряжение в сети .............................................................(220 10) В.

Б.6 Проведение измерений

В инжектор хроматографа, подготовленного по Б.4.5, вводят от 0,02  тщательно отмеренного фильтрата (по Б.4.4) со скоростью потока 1,0 /мин. Степень разрешения пиков лактозы и сахарозы на хроматограмме должно быть не менее 2,0.

Б.7 Обработка результатов измерений

Б.7.1 Массовую долю углеводов (сахарозы, лактозы) в продуктах X, %, вычисляют по формуле:

,

(Б.1)

где - площадь пика, полученная при хроматографировании анализируемой пробы;

V - объем пробы (100 );

- объем стандартного раствора (100 );

- площадь пика, полученная при хроматографировании стандартного образца углеводов;

- масса пробы, взятой для анализа (5 г);

- масса углевода, взятой для приготовления стандартного раствора, г;

0,9 - коэффициент экстракции.

Б.7.2 Вычисления проводят до второго десятичного знака. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости по разделу Б.8.

Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.

Б.8 Контроль точности результатов измерений

Б.8.1 Метрологические характеристики метода определения массовой доли сахарозы, лактозы

Приписанные характеристики погрешности и ее составляющих метода определения массовой доли углеводов при Р = 0,95 приведены в таблице Б.1.

Таблица Б.1

Диапазон измерений массовой доли углеводов, %	Предел повторяемости, , %	Предел воспроизводимости, , %	Границы относительной погрешности, , %
Сахарозы (от 20,0% до 60,0% включ.)	9	17	12
Лактозы (от 0,5% до 20,0% включ.)	4,5	8,5	6,0

Б.8.2 Проверка приемлемости результатов определений, полученных в условиях повторяемости

Проверку приемлемости результатов определений массовой доли сахарозы, лактозы, полученных в условиях повторяемости (два параллельных определения, n = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6. Результаты измерений считаются приемлемыми при условии:

,

(Б.2)

где , - значения двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, %;

- среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, %;

- пределы повторяемости (сходимости), значения которых приведены в таблице Б.1, %.

Если данное условие не выполняется, то проводят повторное определение и проверку приемлемости результатов определений в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6.

Б.8.3 Проверка приемлемости результатов определения, полученных в условиях воспроизводимости

Проверку приемлемости результатов определений массовой доли сахарозы, лактозы, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, m = 2), проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6.

Результаты определений, выполненные в условиях воспроизводимости, считаются приемлемыми при условии:

,

(Б.3)

где , - результаты определений, полученные в двух лабораториях в условиях воспроизводимости, %;

- пределы воспроизводимости, значения которых приведены в таблице Б.1, %;

- среднеарифметическое значение результатов определений, выполненных в условиях воспроизводимости, %.

Если данное условие не выполняется, то процедуры повторяют в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-6.

Б.9 Оформление результатов

Результат измерений массовой доли сахарозы, лактозы в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

,

(Б.4)

где - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, %;

- границы относительной погрешности измерений, % (таблица Б.1).