Наставление по определению санитарного качества молока с помощью набора химических реактивов ЦНИЛ реактивов и ВНИИВС (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 декабря 1964 г. с изменениями от 11 декабря 1965 г.)

1. Набор химических реактивов, предложенный ЦНИЛ реактивов и ВНИИВС, предназначается для:

а) определения эффективности пастеризации молока по реакции на пероксидазу с парафенилендиамином и йодистокалиевым крахмалом (1000 анализов) и по реакции на фосфатазу с фенолфталеинфосфатом натрия (100 анализов);

б) определения свежести молока по его кислотности (1000 анализов);

в) определения качества молока по редуктазной пробе с метиленовым синим (1000 анализов) или резазурином (500 анализов);

г) для исследования молока, полученного от животных, подозрительных по заболеванию маститом, по реакции с бромтимоловым синим (1000 анализов) или с димастином (1000 анализов).

2. В состав набора входят следующие реактивы:

бромтимоловый синий	инд.	2,5 г
димастин (изготовляется ВНИИВС)		50 г
калий йодистый	ч.д.а.	10 г
крахмал растворимый	ч.	10 г
лимонная кислота	ч.д.а.	5 г
метиленовый голубой (фиксанал)		5 ампул
натрий едкий	х.ч.	10 г
натрий фенолфталеинфосфат (в буферной смеси)		100 г
натрий фосфорнокислый однозамещенный	ч.д.а.	250 г
резазурин (импортный)		10 таблеток
соляная кислота (0,1 н. раствор) (фиксанал)		1 ампула
п-фенилендиамин солянокислый	ч.д.а.	5 г
фенолфталеин	инд.	1,5 г

В набор входит также таблица ВНИИВС для определения чистоты молока.

Примечание. Для реакции на пероксидазу используют медицинский продажный 0,5%-ный раствор перекиси водорода.

3. Для проведения указанных анализов необходимо иметь:

колбы мерные на 100, 200 и 500 мл

колбы конические на 150-200 мл

пробирки из бесцветного стекла с пробками

пипетки измерительные на 1, 2, 5, 10 и 20 мл

пипетки на 5-10 мл градуированные с делением 0,1 мл

бюретки со стеклянным краном

капельницы

пипетку-автомат (клювик) на 1 мл

чашки фарфоровые

водяную баню или термостат

молочно-контрольные пластинки

Кроме того, для приготовления растворов бромтимолового синего и фенолфталеина необходим этиловый спирт.

I. Определение эффективности пастеризации молока

4. а. Реакция на пероксидазу с йодистокалиевым крахмалом. Этот метод основан на способности пероксидазы легко разлагать перекись водорода с выделением активного кислорода, который окисляет йодистый калий с выделением свободного йода, а последний окрашивает крахмал в синий цвет.

Для проведения анализа готовят растворы йодистокалиевого крахмала и 0,5%-ный раствор перекиси водорода.

Для получения раствора йодистокалиевого крахмала 3 г крахмала смешивают с небольшим количеством холодной воды. Затем в отдельной колбе доводят до кипения 100 мл воды и при непрерывном помешивании, чтобы не образовалось комков, приливают ее к разведенному крахмалу. Полученный раствор доводят до кипения и после охлаждения к нему добавляют 3 г йодистого калия.

Раствор нестойкий и его следует готовить в небольшом количестве; хранить в темном, прохладном месте.

Для получения 0,5%-ного раствора перекиси водорода к 0,5 мл пергидроля добавляют 30 мл дистиллированной воды; раствор пригоден для использования в течение месяца; должен храниться в склянке из оранжевого стекла.

Техника исследования. В пробирку наливают 5 мл исследуемого молока, затем 5 капель раствора йодистокалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ной перекиси водорода. Содержимое пробирки тщательно перемешивают.

Результат: если молоко пастеризовано правильно, цвет его в пробирке не изменяется. Если молоко пастеризовано с нарушением режима или пастеризовано правильно, но затем к нему добавлено сырое молоко, в испытуемой пробе быстро появляется темно-синяя окраска, как и в пробе сырого молока.

Изменение окраски в исследуемых пробах, наступающее позже 2 минут, не учитывается, так как оно может явиться следствием разложения реактива.

При применении растворов крахмала и йодистого калия раздельно, а не в виде одного реактива, как указано выше, испытание следует проводить так: в пробирку отмеривают 5 мл исследуемого молока, затем приливают 0,5 мл 1%-ного раствора крахмала, 2 капли 10%-ного раствора йодистого калия и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода. Далее поступают так же, как описано выше. Реакцией с йодистокалиевым крахмалом можно установить примесь сырого молока к пастеризованному в количестве от 5%.

б. Реакция на пероксидазу с солянокислым пара-фенилендиамином. Для проведения анализа готовят 2%-ный водный раствор солянокислого пара-фенилендиамина и буферную смесь. Для получения первого раствора 2,5 г солянокислого пара-фенилендиамина растворяют в 125 мл дистиллированной воды. Раствор нестойкий; хранить в склянке из оранжевого стекла с притертой пробкой.

Для приготовления буферной смеси берут 43,25 г однозамещенного фосфорнокислого натрия и 0,65 г кристаллической лимонной кислоты, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, а затем объем доводят до 500 мл. Срок годности раствора 1 месяц.

Техника исследования. В пробирку наливают 5 мл исследуемого молока и 2,5 мл буферной смеси, перемешивают и помещают пробирку в водяную баню при 35° на 3-5 минут. Затем к исследуемой пробе добавляют 6 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода и 3 капли 2%-ного раствора солянокислого пара-фенилендиамина, пробирку снова ставят в водяную баню при том же режиме и наблюдают за изменением окраски.

Результат: если молоко пастеризовано правильно и после этого не добавлялось сырого молока, изменения окраски не наступает; в противном случае появляется темно-синее окрашивание.

в. Реакция на фосфатазу с фенолфталеинфосфатом натрия. Эта реакция является более чувствительной при определении качества пастеризации молока, сливок и кисломолочных продуктов. Метод исследования основан на обнаружении в сыром молоке фермента фосфатазы, который полностью разрушается при нагревании молока при температуре 63° в течение 30 минут. При более высокой температуре (76° и выше) фермент разрушается почти моментально. При добавлении к сырому молоку фенолфталеинфосфата натрия фосфатаза отщепляет от него фосфат и освобождает фенолфталеин, который в щелочной среде дает красное окрашивание, что указывает на присутствие в молоке фосфатазы.

Техника исследования. В пробирку наливают 2 мл исследуемого молока и добавляют 1 мл 0,1%-ного раствора реактива фенолфталеинфосфата натрия. Пробирку закрывают пробкой и после тщательного перемешивания содержимого ее помещают в водяную баню при температуре 40-45°. Реакцию учитывают через 10 минут и через 1 час.

Результат: если молоко пастеризовано (фосфатаза инактивирована), в исследуемой пробе никаких изменений не наблюдается. При нарушении режима пастеризации или добавлении сырого молока наблюдается изменение окраски от светло-розовой до ярко-розовой. Реакцией на фосфатазу можно установить добавление сырого молока к пастеризованному в количестве не менее 2%.

Этой же реакцией можно определить качество пастеризации и других молочных продуктов. Для исследования необходимо взять следующее количество исследуемого продукта и реактивов:

	Количество
	продукта	воды (мл)	децинормального раствора едкого натрия (мл)	раствора фенолфталеинфосфата натрия (мл)
Сливки	2 мл	2	-	1
Кисломолочные продукты	2 мл	2	-	2
Сметана	2 г	2	-	2
Творог, паста ацидофильная	2 г	-	4	2

Исследуемые пробы ставят в водяную баню при температуре 40-45° и результат учитывают через 1 час и 24 часа.

II. Определение свежести молока по кислотности

5. Кислотность молока (в градусах Тернера - Т°) определяется титрованием едким натром по фенолфталеину.

Для проведения анализа готовят децинормальный раствор едкого натра: 8 г химически чистого едкого натра растворяют в 2 л свежепрокипяченной дистиллированной воды и устанавливают его титр по соляной кислоте. Для этого в коническую колбу на 150 мл наливают 20 мл децинормального раствора соляной кислоты, добавляют три капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют приготовленным раствором едкого натра до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты.

Коэффициент поправки щелочи по соляной кислоте рассчитывают по формуле

,

где 20 - объем децинормального раствора соляной кислоты,

Н - объем раствора едкого натра, израсходованного на титрование.

Техника исследования. В коническую колбочку наливают 10 мл исследуемого молока, 20 мл дистиллированной воды, свежепрокипяченной и охлажденной до комнатной температуры, и три капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина.

Содержимое колбочки тщательно перемешивают и из бюретки осторожно, по каплям, прибавляют децинормальный раствор едкого натра до появления слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение минуты.

Результат: количество мл щелочи, пошедшей на титрование, умноженное на коэффициент поправки и на 10, и является показателем кислотности исследуемого молока в градусах Т°.

Можно проводить исследование и без добавления дистиллированной воды, но при этом полученный результат в градусах уменьшают на 2,5.

III. Определение степени бактериальной обсемененности молока по редуктазе

6. Реакция основана на восстановительном действии бактерий на метиленовый голубой или резазурин. (Реакция с резазурином протекает значительно быстрее, чем с метиленовым голубым.)

а. Реакция с метиленовым голубым. Для постановки реакции готовят раствор из реактива фиксанал метиленовый голубой.

С пробирки с фиксаналом предварительно снимают этикетку, тщательно очищают ее и пробку от парафина и промывают наружную поверхность водой. Затем содержимое одной пробирки фиксанала переносят в мерную колбу емкостью 200 мл; пробирку и пробку промывают дистиллированной водой до тех пор, пока промывная вода, которая сливается в эту же мерную колбу, не станет бесцветной. После этого водой доводят объем раствора в колбе до 200 мл и тщательно перемешивают.

Техника исследования. В стерильную пробирку наливают стерильными пипетками 1 мл рабочего раствора метиленового голубого и 20 мл исследуемого молока (сливок). Пробирку сразу же закрывают стерильной корковой или резиновой пробкой, жидкости смешивают и ставят пробирку в водяную баню (редуктазник) или термостат при температуре 38-40°. При этом уровень воды в бане должен быть немного выше уровня молока в пробирке.

Момент смешивания молока с метиленовым голубым записывают как начало испытания, а окончанием исследования считают момент, когда исследуемое молоко в пробирке примет белый цвет. Остающийся иногда в исследуемом молоке небольшой кольцеобразный окрашенный слой вверху или внизу пробирки в расчет не принимается.

Наблюдение за изменением окраски молока отмечают через 20 минут, затем через 2 часа и через 5,5 часа.

Результат: степень бактериальной обсемененности молока и его качество определяются по скорости обесцвечивания исследуемых проб:

Скорость обесцвечивания	Приблизительное количество бактерий в 1 мл молока	Качество молока	Класс
20 минут и менее	Более 20 млн	Очень плохое	IV
От 20 минут до 2 часов	От 4 млн до 20 млн	Плохое	III
От 2 часов до 5 1/2 часа	От 500 тыс. до 4 млн	Удовлетворительное	II
Более 5 1/2 часа	Менее 500 тыс.	Хорошее	I

б. Реакция с резазурином. Для постановки реакции предварительно готовят раствор резазурина: 1 таблетку резазурина растворяют в 50 мл стерильной дистиллированной воды. Срок годности раствора 24 часа.

Техника исследования. В стерильную пробирку наливают 10 мл молока и 1 мл раствора резазурина. Смешивают и ставят ее в водяную баню при 37-38°. Изменение состояния окраски учитывают через 20 минут и 1 час.

Результат: качество молока определяют с помощью прилагаемой к набору цветной таблицы по состоянию окраски исследуемой пробы:

Продолжительность обесцвечивания резазурина	Цвет молока	Качество молока	Класс
До 20 минут	Белое	Очень плохое	IV
Через 1 час	Розовое (до белого)	Плохое	III
Через 1 час	Сине-фиолетовое	Удовлетворительное	II
Через 1 час	Сине-стальное (без изменения первоначального цвета)	Хорошее	I

Реакцией с резазурином можно исследовать молоко, хранившееся при температуре не выше 10° и не более 12 часов. При постановке реакции после добавления к исследуемому молоку резазурина пробы рекомендуется защищать от влияния света.

IV. Исследование молока, полученного от животных, подозрительных по заболеванию маститом

7. С целью определения качества молока, которое подозревается, что оно получено от коров, больных маститом, его исследуют реактивом бромтимоловым синим или димастином.

а. Реакция с бромтимоловым синим. Для постановки реакции готовят раствор: 0,2 г реактива бромтимоловый синий растворяют в 60 мл 95° спирта и затем добавляют 40 мл воды.

Техника исследования. Для исследования необходимо взять молоко непосредственно от коровы, подозреваемой в заболевании маститом. К 5 мл исследуемого молока, взятого в формовую чашечку, добавляют 1 мл раствора бромтимолового синего.

Результат: если молоко взято от коровы, больной маститом, цвет молока изменяется от темно-зеленого до темно-синего. Молоко от здоровых коров окрашивается в желто-зеленоватый цвет.

б. Реакция с димастином. Для постановки реакции готовят 5%-ный раствор димастина (5 г препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды комнатной температуры).

Техника исследования. Молоко исследуется от коров, подозрительных по заболеванию маститом.

В каждую луночку молочно-контрольной пластинки из каждой доли вымени в отдельности выдаивают после доения по 1 мл молока, затем в каждую луночку при помощи автомата-клювика (системы Миронова) вливают по 1 мл 5%-ного раствора димастина и размешивают плоской деревянной палочкой в течение 7-15 секунд.

Результат: молоко из больной доли вымени образует с реактивом плотный сгусток. При раздражениях вымени образуется слабый или средней плотности сгусток. Молоко из здоровых долей с димастином сгусток не образует. Одновременно смесь окрашивается: с молоком, имеющим химическую реакцию в пределах рН 6,4-6,6, - в оранжевый цвет; при рН 6,7-7,0 - в оранжево-красный или красный; при щелочной реакции (рН выше 7,0) - в алый, малиновый; при кислой реакции (рН 6,0-6,2) - оранжево-желтый или желтый.

V. Таблица ВНИИВС для определения чистоты молока

8. Для определения чистоты молока по механической загрязненности с помощью таблицы ВНИИВС берут пробу молока [предварительно перемешанного в бидоне (ведре)] в количестве 250 мл (охлажденное молоко следует подогреть до 35-40°) и фильтруют его через ватный фильтр с помощью прибора "Рекорд".

Фильтр с остатками на нем механических частиц сравнивают с показателями таблицы, указывающей группу молока по загрязненности, соответствующую действующему ГОСТ 8218-56.