Методические рекомендации "Лабораторная диагностика лихорадки КУ" (утв. Минздравом РСФСР 20 марта 1980 г.) (документ не действует)

Методические рекомендации
"Лабораторная диагностика лихорадки КУ"
(утв. Минздравом РСФСР 20 марта 1980 г.)

Микроскопический метод

Прямым подтверждением Ку-риккетсиоза у больного человека (или животных) является обнаружение в соответствующих материалах коксиелл Бернета с помощью иммунолюминесцентного исследования по прямому методу Кунса. Материалом для исследования служит кровь больного. При необходимости обследования позвоночных или беспозвоночных животных (определение источника инфекции) целесообразно готовить мазки на околоплодной жидкости, плаценты абортировавших животных, органов абортированных плодов, гемолимфы и кишечника кровососущих клещей. Исследование вышеперечисленных материалов на инфицированность коксиеллами Бернета иммунолюминесцентным методом проводят следующим образом.

На тщательно вымытом и обезжиренном предметном стекле делают тонкий мазок или отпечаток исследуемого материала. После высыхания мазок фиксируют этиловым спиртом или ацетоном в течение 30 мин. По мазку синим восковым карандашом делают две окружности диаметром 0,5 см, чтобы создать барьер, препятствующий растеканию люминесцирующей сыворотки.

На одно окруженное поле фиксированного и высушенного мазка наносят каплю разведенной флуоресцирующей сыворотки против коксиелл Бернета (рабочее разведение указано на ампуле) в смеси с равным объемом бычьего альбумина, меченного родамином* (в смеси оба конъюгата должны быть в рабочем разведении). На другое поле наносят гетерологичный или "нормальный" конъюгат, также в смеси с бычьим альбумином. Обработку мазков проводят 30 мин при температуре 37°С во влажной камере (чашка Петри с увлажненным дном), что предупреждает высыхание конъюгата. Отмывание мазков от избытка флуоресцирующей сыворотки производят в фосфатном буферном растворе (рН 7,2-7,4) в течение 10 мин. После ополаскивания дистиллированной водой препараты высушивают на воздухе и исследуют в люминесцентном микроскопе.

В мазках крови больного Ку-риккетсиозом человека, биопробных морских свинок и белых мышей коксиеллы Бернета специфически флуоресцируют в виде ярко светящихся мельчайших кокко-бациллярных корпускул зеленого цвета. Характерным является расположение возбудителей на поверхности эритроцитов. В контрольных мазках, обработанных нормальной или гетерологичной флуоресцирующими сыворотками, риккетсии не обнаруживаются. Идентифицировать в мазках крови возбудителя можно при условии, когда в большинстве полей зрения видно не менее 2-3 флуоресцирующих риккетсий, что соответствует примерно 2-5 млн риккетсиальных клеток в 1 мл крови. Риккетсии обнаруживаются в мазках крови больного на высоте лихорадки.

В ходе эпидемиологического обследования, особенно при работе в природных очагах инфекции, а также при проведении эпидемиологической разведки, возникает необходимость лабораторного исследования, в том числе микроскопическими методами, кровососущих клещей и грызунов.

Исследование клещей. После определения вида клещей, их последовательно промывают в стерильном физиологическом растворе, 70° спирте, затем снова в двух порциях физиологического раствора. После этого у клеща отсекают лапки, а выделяющиеся капли гемолимфы распределяют по предметному стеклу. Далее клеща вскрывают, отделяя хитин, и извлекают кишечник, который отмывают в физиологическом растворе, и затем, равномерно растирая, распределяют мазок на предметном стекле. Мазки фиксируют, обрабатывают и исследуют так же, как и мазки крови.

Исследование грызунов. Как правило, при исследовании грызунов на носительство коксиелл используют селезенку, в ретикулярных клетках которой коксиеллы сохраняются в течение длительного срока.

Мазки-отпечатки готовят так же, как при исследовании грызунов на туляремию или псевдотуберкулез. При необходимости более длительного сохранения материала или его перевозки можно использовать 50% стерильный глицерин, в который погружают селезенку. Перед приготовлением мазков её промывают в 2-3 порциях физиологического раствора. Затем из селезенки готовят эмульсию в 5-8 мл физиологического раствора, тщательно растирая её с кварцевым стерильным песком. Через 15-20 мин (после осаждения кусочков ткани) из надосадочной жидкости готовят мазки на предметном стекле; в дальнейшем исследование проводят так же, как при исследовании крови и клещей.

Препараты от клещей и грызунов обрабатывают Ку-риккетсиальной флуоресцирующей сывороткой. В качестве контроля часть мазка (см. выше) целесообразно параллельно обрабатывать антитуляремийной сывороткой (гетерологичный препарат). Это с одной стороны обеспечивает перекрестный контроль на специфичность, с другой - дает прямые результаты на инфицированность грызунов и клещей возбудителями двух инфекционных форм.

Метод биопроб

Для постановки биопроб при Ку-риккетсиозе используют, как правило, тот же материал, что и для микроскопического исследования. Микроскопическое исследование и постановку биопроб проводят обычно параллельно. Для биопроб используют морских свинок (250-300 г), белых мышей (12-14 г) и куриные эмбрионы (7-дневные).

Исследуемый материал растирают, добавляют стерильный физиологический раствор, тщательно эмульгируют и после отстаивания взвеси (или центрифугирования при малых оборотах) вводят внутрибрюшинно или подкожно подопытным морским свинкам (2-3 мл) или белым мышам (0,5-1 мл). При исследовании крови сыворотку отделяют стерильно от сгустка и используют её для серологического исследования. Сгусток растирают с песком, эмульгируют в физиологическом растворе и вводят внутрибрюшинно подопытным животным.

У морских свинок в результате заражения примерно через неделю развивается лихорадка (до 40-41°), продолжающаяся 5-7 дней. Коксиеллы в большом количестве накапливаются в селезенке, печени и других органах. У белых мышей инфекция протекает, как правило, в скрытой форме, с накоплением большого количества коксиелл в селезенке на 7-9-й день после заражения.

Положительный результат экспериментов доказывается обнаружением возбудителей в мазках-отпечатках из органов животных микроскопией, а также выявлением в их сыворотке крови специфических антител.

Серологическое исследование подопытных животных проводят первый раз через 25-30 дней, второй - через 2 месяца. Если при первом исследовании в сыворотке выявлены антитела, то животных убивают, а эмульсией селезенок заражают куриные эмбрионы и параллельно проводят пассаж на свежих морских свинках.

Исходным материалом (особенно сгустком крови) можно заразить и непосредственно куриные эмбрионы. Для этого в желточный мешок 6-7-дневных развивающихся эмбрионов вводят 0,4-0,5 мл взвеси испытуемого материала. Эмбрионы инкубируют в термостате при 35-37° и ежедневно овоскопируют. Эмбрионы, погибшие до 4-го дня включительно, уничтожают (гибель от посторонних причин), а погибшие в более поздние сроки или оставшиеся живыми до предельного срока инкубации (11-12 дней после заражения) помещают в холодильник до вскрытия.

Эмбрионы вскрывают стерильно, берут желточный мешок, каплю содержимого желточного мешка вносят в сахарный бульон с целью контроля на загрязнение посторонней бактериальной флорой. Из кусочка оболочки желточного мешка делают параллельные мазки. Один из них обрабатывают специфической флуоресцирующей сывороткой, а парный окрашивают по Романовскому или по Гименец для световой микроскопии.

Для выделения и пассивирования коксиелл кроме куриных эмбрионов и морских свинок можно использовать белых мышей массой 12-14 г, которых заражают внутрибрюшинно испытуемым материалом. Изолированные культуры коксиелл могут быть лиофильно высушены. В сухом виде культуры коксиелл в холодильнике (+4°С) могут сохраняться в течение десятков лет.

Культивирование коксиелл может осуществляться и в культуре тканей.

Микробиологические исследования с коксиеллами требуют специальных условий, соблюдения особого режима и разрешения на работу с коксиеллами Бернета (II группа)**. Это ограничивает круг практических лабораторий СЭС, работающих по выделению и изучению возбудителей Ку-риккетсиоза. Иммунологические исследования (см. ниже) не требуют особых условий и должны осуществляться повсеместно.

Иммунологические методы

Иммунологические методы диагностики лихорадки Ку включают в себя серологические тесты, из которых наиболее часто применяют реакцию связывания комплемента. Эту реакцию или реакцию агглютинации следует считать обязательной для лабораторного диагноза лихорадки Ку. Кроме того, в настоящее время разработаны дополнительные иммунологические пробы: реакция микроагглютинации (РМА) с диагностикумом из коксиелл Бернета, меченных изотиоционатом флуоресцеина, реакция непрямой иммунофлуоресценции по методу Уиллера-Кунса, реакция кольцепреципитации с растворимым антигеном из коксиелл Бернета 1-й фазы.

Иммунологические реакции применяют для лабораторного подтверждения Ку-риккетсиоза у больных людей и выявления переболевших, обнаружения инфекции у сельскохозяйственных и домашних животных, равно как среда диких грызунов, для оценки эффективности вакцинации и других важных эпидемиологических вопросов. Наконец, серологические реакции - необходимый этап комплекса исследований по изоляции и идентификации возбудителя.

Реакция связывания комплемента (РСК). Сущность реакции заключается в связывании комплемента комплексом антиген + антитело, что обнаруживается в присутствии индикатора (бараньих эритроцитов, сенсибилизированных гемолитической сывороткой). При образовании специфического комплекса антиген + антитело последний связывает комплемент, вследствие чего после добавления гемолитической системы не возникает гемолиза. Если же комплекс ангиген + антитело не образуется, свободный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов. Таким образом, положительный результат РОК характеризуется отсутствием или задержкой гемолиза, а отрицательный - феноменом гемолиза.

Реакцию связывания комплемента можно ставить при 37°С и путем длительного связывания на холоде (при +4°С). Последний способ чувствительнее, но требует большого срока для завершения исследования (около суток); поэтому для диагностических целей обычно применяют метод постановки РСК в термостате, что позволяет закончить исследование в течение одного дня.

Для постановки РСК необходимы 5 ингредиентов: 1) испытуемая сыворотка, 2) антиген, 3) комплемент, 4) гемолитическая сыворотка, 5) эритроциты барана.

Реакцию ставят в общем объеме 0,5 мл, т.е. берут по 0,1 мл каждого ингредиента. Обязательным условием постановки РСК является использование точно оттитрованных компонентов.

Для обеспечения точности получаемых результатов необходимо пользоваться отдельной посудой (пробирки, пипетки, колбы), хорошо вымытой и высушенной в сухожаровом шкафу.

Для каждого ингредиента реакции используют отдельную пипетку. Все разведения делают в свежеприготовленном стерильном физиологическом растворе (0,85% раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде).

Исследуемую сыворотку прогревают перед опытом в течение 30 мин при 56-58°С (для разрушения содержащихся в ней комплемента и ингибиторов).

Антиген, вырабатываемый в СССР для серодиагностики Ку-риккетсиоза с помощью реакции связывания комплемента, представляет собой очищенную взвесь убитых коксиелл Бернета, выращенных в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и находящихся во 2-й фазе. Этот препарат выпускается промышленностью в сухом виде, перед постановкой опыта его разводят физиологическим раствором.

Риккетсиальный антиген титруют те институты, которые его готовят. В соответствии с данными титрования на этикетке сухого антигена указывают объем жидкости, в котором он должен быть растворен. Антиген из коксиелл Бернета 2-й фазы снабжен наставлением по его применению. Учитывая, что у реконвалесцентов и переболевших могут быть антитела и к 1-й фазе возбудителей, серологические исследования желательно проводить в РСК с двумя антигенами из коксиелл Бернета 1-го и 2-го фазовых состояний.

Антигены из коксиелл в 1-й фазе представляют очищенную взвесь убитых коксиелл, прошедших после выделения лишь несколько пассажей на куриных эмбрионах. Антиген 1-й фазы может быть получен и из селезенок белых мышей, инфицированных коксиеллами Бернета в 1-й фазе. Антиген из коксиелл Бернета 1-й фазы в настоящее время промышленностью не выпускается, но он может быть приготовлен в любой лаборатории, имеющей право работы с этим возбудителем.

Комплемент применяют согласно прилагаемой к этому препарату инструкции. Комплемент следует титровать каждый раз перед постановкой опыта.

Гемолитическая сыворотка выпускается в ампулах; это сыворотка кролика, иммунизированного по определенной схеме взвесью бараньих эритроцитов. На этикетке гемолитической сыворотки указан её титр. В опыт гемолитическую сыворотку вводят в тройном титре: например, рабочий титр, указанный на этикетке, равен 1:1800; в этом случае в опыт берут сыворотку, разведенную 1:600. При длительном хранении первоначальный титр гемолитической сыворотки может снижаться. Проверку её титра производят следующим образом. Готовят основное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки + 9,9 мл физиологического раствора). В ряд пробирок последовательно разливают по 0,2 мл разведений сывороток, начиная с 1:1000; в каждую пробирку добавляют комплемент в разведении 1:10 в объеме 0,2 мл и по 0,2 мл 3% взвеси бараньих эритроцитов; затем доливают в каждую пробирку по 0,4 мл физиологического раствора. Смесь ингредиентов выдерживают в термостате при 37°С в течение 1 ч. По наличию полного гемолиза эритроцитов судят о титре сыворотки. Схема титрования гемолитической сыворотки представлена в таблице 1.

Таблица 1

Схема титрования гемолитической сыворотки

Ингредиенты опыта	Разведение гемолитической сыворотки
	1:1000	1:1200	1:1600	1:2000	1:2400	1:2800	1:3000	1:3200	1:3600	1:4000
Гемолитическая сыворотка	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
3% взвесь бараньих эритроцитов	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:10	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Оценка результатов опытов	-	-	-	-	++	++++	++++	++++	++++	++++
Титр гемолитической сыворотки 1:2000

Бараньи эритроциты получают сами. Кровь, взятую из яремной вены барана, дефибринируют во флаконе со стеклянными бусами, процеживают через стерильную марлю и хранят в холодильнике при температуре от 0 до +4°С. Перед опытом дефибринированную кровь многократно отмывают при центрифугировании физиологическим раствором (до исчезновения следов гемолиза) и готовят взвесь эритроцитов.

Титрование комплемента. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента с целью определения его рабочей дозы. Титрование комплемента ведут в присутствии антигена. Из основного разведения комплемента 1:5 или 1:10 готовят различные его дозы в 1 мл (табл. 2).

Таблица 2

Ингредиенты реакции	Дозы комплемента
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Комплемент в разведении 1:10 (мл)	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Физиологический раствор (мл)	0,9	0,8	0,7	0,6	0,5	0,4	0,3	0,2	0,1

Затем ставят опыт титрования комплемента:

Таблица 3

Ингредиенты реакции	Дозы комплемента
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Комплемент в различных дозах	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Антиген	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Оценка результатов	++++	+++	++	+	-	-	-	-	-

Оттитрованный комплемент ставят в термостат при 37°С на 1 ч. Через час добавляют гемолитическую систему (выдержанную в термостате в течение 30 мин) и через 30 мин производят учет результатов.

Оценка результатов титрования комплемента заключается в определении степени задержки гемолиза: отсутствие гемолиза (полная его задержка) обозначается четырьмя крестами (++++); почти полная задержка (следы гемолиза) обозначается тремя крестами (+++); частичная задержка гемолиза оценивается двумя крестами (++) и, наконец, следы задержки (почти полный гемолиз) - одним крестом (+).

Единицей комплемента считают то наименьшее его количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов. В приведенном примере эта единица соответствует 5-й дозе. За полную единицу комплемента принимают вторую пробирку полного гемолиза, в данном примере - 6-я доза. Под рабочей дозой комплемента понимают его количество, содержащееся во второй пробирке с полным гемолизом, т.е. одна полная единица комплемента при проведении связывания в термостате при 37°С в течение 1 ч.

Постановка основного опыта. Испытуемые сыворотки, инактивированные при 56°С 30 мин, разводят физиологическим раствором и разливают в пробирки (или в лунки полистироловых панелей) по 0,1 мл. К различным разведениям исследуемых сывороток добавляют 0,1 мл антигена и 0,1 мл комплемента в его рабочей дозе. После тщательного встряхивания пробирки ставят в термостат при 37°С на 1 ч или в холодильник при +4°С на 16-20 ч (1-я фаза реакции).

Каждый опыт должен сопровождаться следующими контролями:

1) контроль всех испытуемых сывороток (0,1 мл сыворотки в исходном разведении +0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

2) контроль антигена (0,1 мл антигена + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,1 мл физиологического раствора);

3) контроль комплемента (0,1 мл комплемента в рабочей дозе + 0,2 мл физиологического раствора);

4) контроль гемолитической системы (к 0,3 мл физиологического раствора добавляют 0,2 мл гемолитической системы).

Кроме того, необходимо в качестве контроля вводить в опыт заведомо положительную и отрицательную сыворотки с их контролями. Положительную сыворотку разводят до её титра.

На втором этапе в каждую пробирку или лунку панелей добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при 37°С 30 мин. Пробирки или панели тщательно встряхивают и ставят в термостат на 20-30 мин в зависимости от гемолиза эритроцитов в контролях (табл. 4). В пробирках с заведомо положительной сывороткой и в контроле гемолитической системы должна наблюдаться задержка гемолиза.

Таблица 4

Схема постановки основного опыта РСК

Ингредиенты	Разведения сывороток							Контроль сыворотки	Контроль антигена	Контроль комплемента	Контроль гемолитической системы
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640
Сыворотка	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	-	-
Антиген	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	0,1	-	-
Комплемент	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-
Физиологический раствор	-	-	-	-	-	-	-	0,1	0,1	0,2	-
	при 37°С на час
Гемолитическая система	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0,3
	при 37°С на 20-30 мин

Оценка главного опыта заключается в определении степени задержки гемолиза в пробирках с испытуемыми сыворотками по сравнению с соответствующими контролями, в которых возник полный гемолиз. Титром сыворотки считают наибольшее её разведение, характеризующееся задержкой гемолиза на четыре или три креста. При резко положительных результатах феномен задержки гемолиза сохраняется на протяжении ряда часов.

Результаты реакции считают достоверными, если в контролях испытуемых сывороток, в контроле антигена и комплементе имеется полный гемолиз, а в контроле гемолитической системы гемолиз отсутствует.

В связи с тем, что комплементсвязывающие антитела редко обнаруживаются в первые две недели заболевания, РСК мало пригодна для ранней диагностики. Наиболее высокие титры наблюдаются на 4-5-й нед. от начала лихорадки. После перенесения болезни комплементсвязывающие антитела в невысоких титрах (1:10-1:20) сохраняются в крови на протяжении ряда лет, что обеспечивает возможность ретроспективной диагностики лихорадки Ку с помощью этой пробы.

Комплементсвязывающие антитела в сыворотках больных и реконвалесцентов не являются однородными: в острой стадии заболевания образуются антитела к коксиеллам 2-й фазы, а позднее, по мере выздоровления, в сыворотке больных появляются антитела и к 1-й фазе коксиелл.

При дифференцировании положительных результатов РСК анамнестического характера от реакций, наблюдаемых при остром заболевании, учитывают высоту титров, наличие или отсутствие динамики накопления комплементсвязывающих антител, а при возможности и соотношения lgM и lgG антител. Эти критерии следует принимать во внимание и при постановке других серологических проб.

Реакция агглютинации (РА). Реакций ставят в пробирках в объеме 0,4 мл. К восходящим разведениям прогретой сыворотки, начиная с 1:5 в объеме 0,2 мл, добавляют равный объем антигена. Каждый опыт сопровождают контролем исследуемой сыворотки (к 0,2 мл основного её разведения добавляют 0,2 мл физиологического раствора), рекомендуется в качестве контроля исследовать также заведомо положительную и отрицательную сыворотки. Реакцию проводят в термостате при 37°С в течение 18-20 ч. Результаты её учитывают через 2 ч после выдерживания при комнатной температуре. Положительные реакции характеризуются возникновением агглютината на дне пробирки.

Учёт результатов РА осуществляют обязательно с помощью агглютиноскопа. Оценку интенсивности положительных реакций проводят по следующей условной шкале: полное просветление надосадочной жидкости и компактные агглютинаты обозначают тремя крестами (+++); неполное просветление при наличии четких агглютинатов - двумя крестами (++); слабо выраженные агглютинаты оцениваются одним крестом (+). При заключении о титре сыворотки слабоположительные реакции (+) не принимают в расчет. Контроль антигена - равномерно мутная взвесь. Контроль сыворотки должен быть прозрачным.

В качестве антигена используют производственные серии диагностикума, предназначенного для РСК (2-я фаза)***, так как он является корпускулярным, что необходимо для РА. В данной реакции этот антиген используют обычно в удвоенной концентрации (в ампулу с сухим антигеном добавляют физиологический раствор в объеме в 2 раза меньшем, чем указано на этикетке).

Для подтверждения острого заболевания, как и при использовании других реакций, необходимо учитывать нарастание концентрации антител в динамике.

Реакция непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Эта реакция демонстративна благодаря феномену люминесценции и не уступает по специфичности к чувствительности другим серологическим тестам. С помощью этой пробы можно выявить антитела на более ранних сроках, чем в РСК.

РНИФ может быть использована для диагностики Ку-рикккетсиоза у больных, для ретроспективного исследования переболевших, а также для определения инфицированности коксиеллами крупного и мелкого рогатого скота.

Постановка РНИФ. 1-й этап. Сухой антиген из коксиелл Бернета 2-й фазы, используемый для серодиагностики лихорадки Ку в РСК, является корпускулярным, поэтому он может быть использован в РНИФ.

В ампулу с сухим антигеном за день до приготовления препаратов добавляют 1 мл дистиллированной воды с целью насыщения корпускул коксиелл влагой. На следующий день из этого основного разведения готовят рабочее разведение в физиологическом растворе до концентрации, обеспечивающей в каждом поле зрения примерно 200-300 риккетсиальных клеток при исследовании препаратов, обработанных по прямому методу флуоресцирующих антител.

На предметные стекла, хорошо вымытые и обезжиренные, наносят капли антигена в соответствующем рабочем разведении. На каждое стекло наносят 4-8 мазков. Этого количества достаточно для испытания одной или двух сывороток.

Мазки хорошо высушивают на воздухе, фиксируют спиртом или ацетоном в течение 20 мин и сохраняют до использования при температуре от 0 до +4°С. Препараты необходимо оберегать от увлажнения. Такие мазки пригодны для работы в течение месяца.

Из испытуемых сывороток, предварительно прогретых в течение 30 мин при 56°С, готовят двукратные разведения в физиологическом растворе (от 1:10 до 1:80, а при необходимости и выше).

2-й этап. Каждую каплю антигена, прежде чем нанести испытуемую сыворотку, обводят восковым карандашом, чтобы создать ориентир (облегчающий микроскопирование) и барьер, препятствующий растеканию испытуемой сыворотки, а на втором этапе - флуоресцирующего антивидового конъюгата. Разведения сыворотки наносят на мазки антигена и выдерживают 45 мин во влажной камере при 37°С. Затем препарат промывают фосфатным буферным раствором (рН 7,2-7,4) в течение 10 мин и высушивают на воздухе.

3-й этап. После высушивания на мазки наносят антивидовой (соответствующий испытуемой сыворотке) люминесцирующий гамма-глобулин в рабочем разведении (это разведение указано на этикетке каждой ампулы); мазки вновь выдерживают во влажной камере 30 мин при 37°С. В качестве антивидовых препаратов применяют люминесцирующие сыворотки против гамма-глобулина человека, коровы, овцы и т.д. (в зависимости от видовой принадлежности испытуемых сывороток).

Далее препараты промывают в двух порциях буфера в течение 10 мин и высушивают на воздухе.

В качестве контроля в каждый опыт вводят заведомо положительную и отрицательную сыворотки. Контроль люминесцирующей антивидовой сыворотки: антиген обрабатывают непосредственно антивидовой люминесцирующей сывороткой.

4-й этап. Учет результатов реакции. Препараты исследуют в люминесцентном микроскопе (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-Д, ЛЮМАМ), объектив 90х, окуляр 8х. Первичные светофильтры для МЛ-2 - ФС 1-4; СЗС 7-2; БС8-2, окулярный или запирающий - 2; для ЛЮМАМ - ФС 1-4; СЗС 21-2; ФС 1-6; окулярный зеленый (т.е. фильтры, которые обычно используют для препаратов, обработанных конъюгатами изотиоцианата флуоресцеина).

Просматривают не менее 20 полей зрения. Оценку результатов титрования сывороток проводят на основании яркости флуоресценции коксиелл в антигене. Для этого используют условную систему обозначения при помощи крестов.

++++ - яркая, сверкающая флуоресценция;

+++ - отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция с характерным для данного флуорохрома цветом (в данном случае зеленый). Морфология риккетсий выявляется хорошо, у отдельно лежащих корпускул видны четкие колечки (ободки) за счет более яркого свечения комплекса антител с поверхностным антигеном;

++ - флуоресценция слабая, морфология клеток и цвет люминесценции выявляется достаточно четко;

+ - флуоресценция очень слабая, морфология риккетсий различима плохо, цвет неопределенный;

- - флуоресценция отсутствует.

Титром сыворотки считают то наибольшее её разведение, которое обусловливает свечение риккетсий на ++.

Контроль флуоресцирующей антивидовой сыворотки - свечение риккетсий отсутствует при обработке антигена флуоресцирующей антивидовой сывороткой в рабочем разведении.

Определение класса антител к коксиеллам Бернета в диагностике Ку-риккетсиоза

Упомянутые выше серологические тесты позволяют дифференцировать иммунологический ответ, возникающий в результате "острого" инфекционного процесса при лихорадке Ку, от следовых реакций, как правило, только при использовании парных сывороток, что обусловливает позднее распознавание природы болезни и не всегда рациональное лечение больных. Дифференцирование антител по классам иммуноглобулинов расширяет возможности серологических реакций и позволяет в ряде случаев диагностировать Ку-лихорадку без обязательного исследования сывороток в динамике. Этот метод может быть с успехом использован в крупных лабораториях.

Метод основан на том, что редуцирующие вещества, содержащие сульфгидрильные группы (этантиол, цистеин, меркамин и др.) разрушают дисульфидные связи, соединяющие субъединицы макроиммуноглобулинов, в результате чего эти иммуноглобулины теряют антительную активность. С целью дифференцирования антител исследуемые сыворотки, разведенные 1:5 в свежеприготовленном физиологической растворе, смешивают с равным объемом редуцента - этантиола (в конечном разведении последнего 0,06 М), пробирки тщательно закрывают резиновыми пробками. Контрольные порции сывороток (без этантиола) смешивают с физиологическим раствором. Опытные и контрольные пробы выдерживают при комнатной температуре 3 ч, после чего прогревают 30 мин при 56°С. Работа с этантиолом должна проводиться в вытяжном шкафу, так как этот препарат обладает большой летучестью и неприятным запахом. Контрольные и опытные порции сывороток исследуют в РСК по вышеописанной методике. Если концентрация антител в обработанных и необработанных сыворотках совпадает, их определяют как lgG антитела. Четырехкратное и более снижение титров антител в сыворотках, подвергшихся воздействию этантиола, по сравнению с контрольными, рассматривают как преобладание в сыворотке lgM антител. Обнаружение lgM антител является показателем "свежести" иммунологического ответа при Ку-лихорадке и подтверждает диагноз без обязательного повторного серологического обследования больных.

______________________________

* Меченный родамином бычий альбумин применяют для снижения неспецифического сечения исследуемой ткани, а также органических и неорганических частиц, содержащихся в материале.

** См. "Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями чумы, холеры, сапа, мелиодаза, натуральной оспы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза" (1974).

*** При наличии антигена из коксиелл Бернета 1-й фазы реакцию лучше ставить с обоими антигенами.

ОТРЫВНОЙ ЛИСТ
учета эффективности методических указаний по лабораторной диагностике лихорадки Ку

                                                    Направить в научно-

                                                    организационный отдел

                                                    ЛНИИЭМ имени Пастера

                                                    (197101, Ленинград,

                                                    ул. Мира, 14)

1. Методические рекомендации "Лабораторная диагностика лихорадки Ку"

2. Утверждены заместителем министра здравоохранения РСФСР К.И. Акуловым 20 марта 1980 г.

3. Результаты применения методических указаний

      положительные _____________________________________________________

                                    количество наблюдений

      неопределенные ____________________________________________________

                                    количество наблюдений

      отрицательные _____________________________________________________

                                    количество наблюдений

      Общее количество наблюдений _______________________________________

      Наблюдения проводились с _______________ по _______________ 19   г.

      4. Замечания и пожелания (текст) __________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Подпись _________________________________________________________________

                   должность, Ф.И.О. лица, заполняющего карту

Заместитель министра

К.И. Акулов

Согласовано:

Зам. начальника Главного управления НИИ и координации научных исследований

Н.А. Демидов

20 марта 1980 г.