Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 13136-2016 "Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп О157, О111, О26, О103 и О145" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 7 ноября 2016 г. N 1606-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 13136-2016
"Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп О157, О111, О26, О103 и О145"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 7 ноября 2016 г. N 1606-ст)

Microbiology of food and animal feed. Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens. Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of О157, О111, О26, O103 and О145 serogroups

МКС 07.100.30

65.120

67.050

Дата введения - 1 июля 2017 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2015 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Федеральным государственным бюджетным научным учреждением "Всероссийский научно-исследовательский институт технологии консервирования" (ФГБНУ "ВНИИТеК") на основе официального перевода на русский язык англоязычной версии международного документа, указанного в пункте 5, который выполнен ФГБНУ "ВНИИТеК"

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 июля 2016 г. N 89-П)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Армения	AM	Минэкономики Республики Армения
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Россия	RU	Росстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 7 ноября 2016 г. N 1606-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 13136-2016 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу ISO/TS 13136:2012 "Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, О103 и O145" [Microbiology of food and animal feed - Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens - Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups", IDT].

Международный документ разработан Техническим комитетом по стандартизации ISO/TS 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 Введен впервые

Введение

Escherichia coli, продуцирующая Шига-токсин (STEC), является патогенной кишечной палочкой, которая может вызывать диарею, а также более тяжелые заболевания человека, такие как геморрагический колит и гемолитико-уремический синдром (ГУС). Хотя существует большое количество серогрупп STEC, серогруппы O157, O26, O111, О103 и O145 гарантированно вызывают наиболее тяжелые заболевания, в частности, ГУС (см. [1]).

Примечание - Необходимо принимать во внимание все виды Escherichia coli, выделяющие Шига-токсин, поскольку они патогенны для человека и потенциально способны вызвать тяжелые заболевания в зависимости от характеристик рисков, которые несут в себе продовольственные товары (готовая к употреблению пищевая продукция или пищевая продукция, предназначенная для потребления после технологической обработки, такой как пастеризация, приготовление пищи и т.п., проводимой с целью снижения широкого спектра бактерий, присутствующих в пищевой продукции), а также от состояния здоровья людей, потребляющих пищевую продукцию.

Кроме того, учитывая высокую геномную пластичность данного вида бактерий, не исключено, что новые механизмы вирулентности могут приводить к созданию новых серопатогрупп, таких как продуцирующая Шига-токсин энтероагрегативная серопатогруппа Е. coli O104, которая вызвала вспышки ГУС в Германии и Франции в мае и июне 2011 г. Новые атипичные серопатогруппы Е. coli могут образовываться в результате трансформации генов stx при воздействии бактериофага на штамм Е. coli, патогруппы которого не продуцируют Шига-токсин.

Метод, установленный в настоящем стандарте, распространяется на данные атипичные штаммы и они могут быть надежно выявлены, поскольку в них присутствуют гены stx.

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод идентификации бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин (STEC), посредством обнаружения следующих генов:

a) основных генов вирулентности STEC, stx и еае (см. [2], [3]);

b) генов, входящих в состав ДНК бактерий Escherichia coli серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145 (см. [3], [4]).

При обнаружении одного или обоих видов генов stx проводят разделение штаммов.

Выделение STEC из проб, в которых присутствуют бактерии с генами, характерными для серогрупп, на которые распространяется метод настоящего стандарта, можно упростить путем использования методик обогащения, предназначенных для работы с серогруппами (например, иммуномагнитного разделения).

В методе, установленном в настоящем стандарте, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени используют в качестве контрольной методики обнаружения генов вирулентности и генов, присутствующих в геноме серогрупп.

Настоящий стандарт распространяется на:

1) продукцию, предназначенную для потребления человеком и кормления животных;

2) пробы окружающей среды, взятые из зоны производства пищевых продуктов и осуществления технологических операций с пищевыми продуктами;

3) пробы окружающей среды из зоны производства сырья.

В настоящем стандарте применены следующие условные обозначения:

- stx: гены, ответственные за синтез Шига-токсина (используют также синоним - vtx);

- Stx: Шига-токсин [используют также синоним - Vtx (веротоксин)];

- STEC: Escherichia coli, выделяющие Шига-токсин [используют также синоним - VTEC (Escherichia coli, выделяющие веротоксин)];

- еае: гены интимина.

2 Нормативные ссылки

Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. В случае недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).

ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs. General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)

ISO 20838 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens. Requirements for amplification and detection for qualitative methods (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Требования к амплификации и детектированию для качественного анализа)

ISO 22174 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens. General requirements and definitions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах. Общие требования и определения)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 Escherichia coli, продуцирующие Шига-токсин; STEC [Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC)]: Штаммы Е. coli, имеющие гены, ответственные за синтез Шига-токсина

3.2 Escherichia coli, продуцирующие Шига-токсин (STEC), вызывающие повреждение путем прикрепления бактерий и разрушения ими щеточной каймы эпителия клеток кишечника (Shiga toxin-producing Escherichia coli causing the attaching and effacing lesion, STEC causing the attaching and effacing lesion): Штаммы Е. coli, имеющие гены, ответственные за синтез Шига-токсина и ген, ответственный за синтез интимина (еае).

Примечание - Данная комбинация генов вирулентности часто бывает причиной наиболее тяжелых форм болезней, вызванных STEC.

3.3 Escherichia coli, продуцирующие Шига-токсин (STEC), серогруппы которых являются высокопатогенными (Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to highly pathogenic serogroups, STEC belonging to highly pathogenic serogroups): Штаммы Е. coli, имеющие гены, ответственные за синтез Шига-токсина, ген, ответственный за синтез интимина (еае) и относящиеся к серогруппам O157, O111, O26, O103 и O145.

4 Сущность метода

4.1 Общие положения

Используемый метод состоит из следующих последовательных этапов:

a) микробное обогащение;

b) выделение нуклеиновых кислот (ДНК);

c) выявление генов вирулентности;

d) выявление генов, присутствующих в серогруппах;

e) селекция из положительных проб.

Примечание - Блок-схема проведения исследования представлена на рисунке А.1.

4.2 Микробное обогащение

Бактерии STEC выявляют после увеличения их количества путем инкубирования анализируемой пробы в неселективной жидкой питательной среде, например:

a) модифицированный триптон-соевый бульон (триптон-соевый бульон с добавлением соли желчных кислот N 3, концентрация которой - 1,5 , и добавлением новобиоцина, концентрация которого - 16 ) - mTSB+N;

b) забуференная пептонная вода (BPW);

c) модифицированный триптон-соевый бульон (триптон-соевый бульон с добавлением соли желчных кислот N 3, концентрация которой - 1,5 , и добавлением акрифлавина, концентрация которого - 12 ) - mTSB+A, для анализа молока и молочных продуктов.

mTSB используют при анализе проб, предположительно содержащих большие количества нецелевых микроорганизмов.

Новобиоцин и акрифлавин подавляют рост грамположительных бактерий и способствуют росту грамотрицательных бактерий, в том числе STEC.

BPW применяют для анализа проб, которые предположительно содержат подвергнутые стрессу целевые бактерии (например, пробы замороженных продуктов), чтобы реанимировать подвергнутые стрессу бактерии STEC, и предположительно содержащие меньшее количество нецелевых микроорганизмов, чем свежие пробы.

Примечание - Добавление новобиоцина является спорным и было исследовано несколькими авторами. Было установлено, что минимальная ингибирующая концентрация антибиотика для бактерий STEC, не относящихся к серогруппе O157, ниже, чем для штаммов серогруппы O157 (см. [5]). Добавление новобиоцина при обогащении в mTSB, когда концентрация новобиоцина является типичной (20 ), как это установлено в [19], приводило к подавлению роста приблизительно одной трети клеток штаммов бактерий, не относящихся к серогруппе O157 (см. [6]), что повышает риск ложно-отрицательных результатов.

4.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)

Нуклеиновые кислоты экстрагируют в соответствии с требованиями используемой системой ПЦР в режиме реального времени.

4.4 Выявление целевых генов

Очищенную ДНК используют для обнаружения следующих целевых генов:

- основные гены вирулентности для STEC: генов stx, кодирующих токсины Шига и еае-гена, кодирующего белок массой 90 кда - интимин, участвующих в механизме адгезии, которая является характерным признаком штаммов STEC, вызывающих тяжелые заболевания. Гены stx кодируют семейство токсинов, в том числе два основных типа: stx1 и stx2. Stx2 состоит из семи четко установленных вариантов - от stx2a до stx2g (см. [22]). Варианты генов stx2a, stx2b и stx2c, присутствующие в штаммах бактерий STEC, в числе генов, которые приведены в разделе 1, представляют собой целевые гены, кодирующие Шига-токсин, на которые распространяется настоящий стандарт.

В базе данных GenBank генам, кодирующим данные варианты stx2, присвоены следующие обозначения: stx2a: X07865; stx2b: L11078; stx2c: M59432.

- ген еае, кодирующий интимин;

- гены для определения соответствующей серогруппы: rfbE(O157), wbdl(O111), wzx(O26), ihp1(О145) и wzx(O103).

4.5 Выявление

Выявление целевых генов проводят в соответствии с требованиями используемой системы ПЦР в режиме реального времени.

4.6 Селекция из положительных проб

Если есть подозрение, что в пробе присутствуют STEC, проводят селекцию микроорганизмов. В случае обнаружения по меньшей мере одной серогруппы, которая описана в разделе 1, допускается проводить обогащение данной серогруппы (например, методом иммуномагнитного разделения), после чего проводят посев на агар с триптоном, желчью и глюкуроновой кислотой (ТВХ) или на определенную селективную среду, если существует такая возможность (см. приложение F, примечания 2 и 3). Данную операцию проводят с целью облегчения отделения STEC от фоновой микрофлоры.

5 Разбавители, питательные среды и реактивы

В ходе проведения анализа, если не указано иное, используют реактивы только признанной аналитической степени чистоты и стерильную, дистиллированную, деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.

5.1 Питательные среды

5.1.1 Модифицированный триптон-соевый бульон (mTSB)

5.1.1.1 Базовый состав и рН среды

Ферментативный перевар казеина - 17 г;

Ферментативный перевар сои - 3 г;

D(+)-глюкоза - 2,5 г;

Натрия хлорид - 5 г;

Калий фосфорнокислый двухзамещенный () - 4 г;

Соли желчных кислот N 3 - 1,5 г;

Дистиллированная вода - до 1000 ;

рН (7,4 0,2) ед. рН.

Процедура приготовления среды следующая: компоненты сухой питательной среды растворяют в воде. Устанавливают рН на уровне (7,40,2) ед. рН при температуре 25 °С и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

5.1.1.2 Раствор новобиоцина

Состав раствора:

Новобиоцин - 0,16 г;

Вода - 10 .

Процедура приготовления раствора следующая: новобиоцин растворяют в воде и стерилизуют путем мембранной фильтрации с помощью фильтров с размерами пор 0,22 мкм или 0,45 мкм.

Раствор готовят в день его использования.

5.1.1.3 Раствор акрифлавина

Состав раствора:

Акрифлавин - 0,12 г;

Вода - 10 .

Процедура приготовления раствора следующая: акрифлавин растворяют в воде и стерилизуют путем мембранной фильтрации с помощью фильтров с размерами пор 0,22 мкм или 0,45 мкм.

Раствор готовят в день его использования.

5.1.1.4 Приготовление готовой питательной среды

Непосредственно перед использованием 1 раствора новобиоцина (см. 5.1.1.2) или раствора акрифлавина добавляют (см. 5.1.1.3) к 1000 охлажденного бульона mTSB (см. 5.1.1.1).

Конечная концентрация новобиоцина в mTSB должна быть 16 .

Конечная концентрация акрифлавина в mTSB должна быть 12 .

5.1.2 Забуференная пептонная вода (BPW)

Состав и рН BPW:

Пептоны - 10 г;

Натрия хлорид - 5,0 г;

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный двенадцативодный () - 3,5 г;

Калий фосфорнокислый однозамещенный () - 1,5 г;

Вода - до 1000 ;

рН (7,0 0,2) ед. рН.

Процедура приготовления BPW следующая: компоненты сухой питательной среды растворяют в воде. Устанавливают рН на уровне (7,00,2) ед. рН при температуре 25 °С и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин.

5.2 Реактивы для экстракции нуклеиновых кислот (ДНК)

Реактивы, используемые для экстракции нуклеиновых кислот, не приведены в настоящем пункте, поскольку они могут быть разными в зависимости от используемого метода (см. 9.3).

5.3 Реактивы, используемые при проведении ПЦР

Используют реактивы, приведенные в ISO 20838.

5.3.1 Олигонуклеотиды (праймеры) и зонды обнаружения

Праймеры и зонды для обнаружения конкретных целевых последовательностей генов стандартными методами ПЦР и методами ПЦР в режиме реального времени приведены в приложениях С и Е.

6 Оборудование и лабораторная посуда

Используют обычное оборудование, необходимое для микробиологической лаборатории (см. ISO 7218) и, в частности, следующее.

6.1 Баня водяная или нагревательный блок, способные поддерживать температуру до 100 °С.

6.2 Термостат (см. ISO 7218), способный поддерживать температуру на уровне (371) °С.

6.3 Оборудование для выделения нуклеиновых кислот (ДНК), выбираемое в зависимости от используемого метода, при необходимости.

6.4 Пипетки вместимостью от 1 до 100 (см. [16]).

6.5 Тонкостенные микропробирки для проведения ПЦР в режиме реального времени, вместимостью 0,2 и 0,5 , многолуночные микропланшеты для проведения ПЦР или другая подходящая прозрачная одноразовая пластиковая лабораторная посуда.

6.6 Амплификатор, некоторые торговые марки которого доступны на рынке и который выбирают в зависимости от методов, используемых в лаборатории.

6.7 Прибор для обнаружения продуктов ПЦР

Прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени позволяет обнаружить световое излучение, которое появляется после ПЦР-анализа с использованием 5'-нуклеазы.

6.8 Перистальтический смеситель со стерильными пакетами, в некоторых случаях оснащенный прибором регулирования скорости и времени.

7 Отбор проб

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Информация об отборе проб приведена в определенных стандартах на конкретную продукцию, а также в определенных нормативных документах. В случае, когда стандарт, где приведена информация об отборе проб конкретного вида продукции, отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к соглашению по данному вопросу.

В лабораторию необходимо доставить представительную пробу, которая не была повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.

8 Подготовка пробы для испытания

Испытуемую пробу подготавливают в соответствии с конкретным стандартом на конкретный вид продукции. В случае, когда стандарт, где приведена информация о подготовке проб конкретного вида продукции, отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к соглашению по данному вопросу.

9 Методика проведения испытания

9.1 Приготовление анализируемой пробы и исходной суспензии

9.1.1 Общие положения

Используют количество среды для обогащения, необходимое для получения окончательного разведения первоначальной анализируемой пробы.

9.1.2 Приготовление анализируемых проб с предположительно высоким уровнем фоновой микрофлоры

В случае твердых проб пищевой продукции порцию анализируемой пробы (х г) в стерильных условиях переносят в мешок перистальтического смесителя, содержащий 9х бульона mTSB, в который добавлен новобиоцин или акрифлавин (см. 5.1.1.4). Рекомендуется использовать мешки, оснащенные фильтрами.

Полученную смесь гомогенизируют в смесителе (см. 6.8; см. ISO 7218).

В случае жидких проб пищевой продукции порцию анализируемой пробы (х ) в стерильных условиях переносят в мешок перистальтического смесителя, содержащий 9х бульона mTSB для обогащения, в который добавлен новобиоцин или акрифлавин (см. 5.1.1.4).

9.1.3 Приготовление анализируемых проб, предположительно содержащих целевые бактерии, подвергнутые стрессу

Замороженные пробы размораживают при комнатной температуре, затем порцию анализируемой пробы (х г или х ) переносят в мешок перистальтического смесителя или пробирку, содержащую 9х BPW (см. 5.1.2) и далее действуют, как это описано выше.

9.2 Обогащение

9.2.1 Инкубирование

Содержимое мешка перистальтического смесителя, пробирки или флакона (см. 9.1.2) инкубируют при температуре (37 1) °С в течение 18 - 24 ч.

9.2.2 Контроль над процессом (для ПЦР в реальном времени)

Контроль над процессом выполняют в соответствии с положениями, изложенными в ISO 22174.

Руководство по внутреннему контролю амплификации (IAC) и контролю над процессом приведены в приложении D и С.3.8.

9.3 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)

Методики экстракции нуклеиновых кислот (ДНК) должны соответствовать методикам, применяемым в отношении грамотрицательных бактерий. Полный перечень методов приведен в [10]. Кроме того, допускается использовать имеющиеся в продаже наборы в соответствии с инструкциями изготовителя.

9.4 ПЦР-амплификация (для ПЦР в режиме реального времени)

9.4.1 Общие положения

Используемый процесс ПЦР-амплификации применяют при проведении ПЦР в режиме реального времени.

Необходимо выполнять все требования к ПЦР-амплификации, которые изложены в ISO 20838.

Информация о праймерах и зондах для обнаружения, использующихся при проведении ПЦР в режиме реального времени, приведена в приложении Е.

9.4.2 Обнаружение продуктов ПЦР

Прибор для обнаружения продуктов ПЦР улавливает световое излучение, как только оно возникает в процессе амплификации.

9.4.3 Интерпретация результатов ПЦР-анализа

Результаты, полученные при проведении ПЦР, в том числе контрольные, информация о которых приведена в ISO 22174 и в приложении D, обрабатывается программным обеспечением прибора для амплификации. В ходе процесса амплификации программное обеспечение прибора контролирует ПЦР-амплификацию с использованием 5'-нуклеазы посредством анализа интенсивности флуоресценции репортерного красителя для каждой пробы, . - это разность и контрольного значения интенсивности флуоресценции репортерного красителя, определенного в результате первых нескольких циклов. Значение порогового цикла, , определяют как номер цикла, при котором значение интенсивности флуоресценции данной пробы превышает установленное значение порогового цикла.

В случае, если были получены сомнительные результаты, проводят проверку кривых значений излучения на графике. Для проб, демонстрирующих положительный результат, характерна кривая, на которой явно выражено усиление флуоресценции, начиная с количества циклов, значения которых соответствуют .

Если полученные значения приводят к непредвиденным результатам, то анализ повторяют.

Данный метод является последовательным (см. блок-схему на рисунке А.1). Стадии данного метода следующие:

- стадия 1: обнаружение генов, кодирующих Шига-токсин и гена, кодирующего интимин (см. ПЦР А, приведено в приложении Е; данную процедуру можно также провести с помощью дуплексной ПЦР);

- стадия 2 а): проведение испытания проб, содержащих бактерии с генами stx и eae гена, на молекулярное серогруппирование (см. ПЦР Б, приведено в приложении Е);

- стадия 2 б): Выделение штаммов бактерий из проб, бактерии в которых содержат гены, кодирующие Шига-токсин; допускается использовать метод обогащения конкретных серогрупп (например, иммуномагнитное разделение) для повышения эффективности отделения клеток бактерий STEC от проб, содержащих хотя бы одну из серогрупп, приведенных в разделе 1 (см. 9.5 и рисунок В.1).

9.5 Выделение штаммов

Выделение штаммов бактерий STEC необходимо для подтверждения того, что положительный результат ПЦР-анализа получен из ДНК именно этих живых бактериальных клеток.

В случае наличия одного из генов, характерных для серогрупп, приведенных в разделе 1, допускается проведение обогащения конкретной серогруппы с целью повышения эффективности стадии выделения, после чего проводят прямой посев на подходящую плотную среду и скрининг колоний на наличие генов вирулентности.

Для подтверждения наличия генов вирулентности в выделенных колониях используют протоколы, описывающие проведение стандартной ПЦР, ПЦР в режиме реального времени (см. приложения С и Е), а также протокол проведения любого другого вида ПЦР, которая аналогична ранее указанным видам ПЦР.

Блок-схема выделения бактерий STEC приведена на рисунке В.1, а методика данной процедуры - в приложении F.

10 Интерпретация результатов

a) Пробы, не содержащие бактерий с stx-геном: в х г или х анализируемой пробы STEC не обнаружены (см. ISO 7218).

При отсутствии генов stx, проведение испытания прекращают и не проводят дальнейшего определения наличия гена еае и генов, присутствующих в серогруппах, приведенных в разделе 1.

В случае, когда не удалось провести выделение бактерий из проб, положительных на наличие stx-генов, тогда:

b) Пробы, положительные на наличие stx-генов: в х г или х анализируемой пробы предположительно обнаружены STEC.

c) Пробы, положительные на наличие генов stx и еае: в х г или х анализируемой пробы предположительно обнаружены STEC, вызывающие повреждение путем прикрепления бактерий и разрушения ими щеточной каймы эпителия клеток кишечника.

d) Пробы, положительные на наличие генов stx и еае, а также генов, характерных для одной из серогрупп, приведенных в разделе 1: в х г или х анализируемой пробы предположительно обнаружена серогруппа STEC XX*.

В случае, когда удалось провести выделение и подтверждение бактерий из проб, положительных на наличие stx-генов, тогда:

e) Выделенные штаммы Е. coli, положительные на наличие stx-гена: наличие STEC в х г или х анализируемой пробы.

f) Выделенные штаммы Е. coli, положительные на наличие генов stx и еае: в х г или х анализируемой пробы обнаружены STEC, вызывающие повреждение путем прикрепления бактерий и разрушения ими щеточной каймы эпителия клеток кишечника.

g) Выделенные штаммы Е. Coli, положительные на наличие генов stx и еае, а также генов, характерных для одной из серогрупп, приведенных в разделе 1: обнаружена серогруппа STEC XX** в х г или х анализируемой пробы.

11 Эксплуатационные характеристики

11.1 Метод ПЦР в режиме реального времени, установленный в настоящем стандарте, прошел процедуру валидационного исследования в соответствии с требованиями, приведенными в [17].

11.2 Чувствительность и предел обнаружения бактерий методом ПЦР в режиме реального времени были определены с помощью разведений плазмид, содержащих клонированные гены, кодирующие специализированную экспрессию (см. [8]). Результаты данного исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Чувствительность и предел обнаружения 5'-нуклеазы с помощью ПЦР для некоторых генов, рассматриваемых в настоящем стандарте (см. [8]).

Целевой ген	Предел обнаружения, количество копий за реакцию	Эффективность, %
stx1	5	94,7
stx2	5	94,0
rfbE	1	94,2
wbdl	5	94,0
wzx	5	97,7
ihp1	5	99,6

Дополнительное исследование (см. [17]) проводилось с целью определения эффективности предлагаемых подходов к проведению ПЦР в режиме реального времени при анализе смешанных культур серогрупп STEC, приведенных в области применения настоящего стандарта; при этом предполагается использовать лабораторный штамм К-12 (С600). Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Обнаружение малого числа бактерий STEC в смешанных культурах (см. [15])

Серотип STEC		Предел обнаружения
Серотип STEC		stx1/stx2	eae	rfbE (O157)	wbd1 (O111)	wzx (O103)	ihp1 (O145)	fliC (H7)	wzx (O26)
O26:Н11	2 - 3	28 - 31	31 - 32	-	-	-	-	-	31 - 33

	10 - 20	25 - 27	28 - 29	-	-	-	-	-	29
О103:Н2	2 - 3	29 - 30	31 - 32	-	-	32 - 33	-	-	-

	10 - 20	26 - 27	29 - 30	-	-	29 - 31	-	-	-
O111:[Н8]	2 - 3	26 - 27	30 - 31	-	30 - 31	-	-	-	-

	10 - 20	24 -25	29 - 30	-	27 - 28	-	-	-	-
O145:[Н28]	2 - 3	32 - 33	31 - 32	-	-	-	31 - 34	-	-

	10 - 20	30 - 32	29 - 31	-	-	-	30	-	-
O157:Н7	2 - 3	29 - 30	29 - 31	31 - 32	-	-	-	33 - 38	-

	10 - 20	26 - 28	26 - 29	29 - 31	-	-	-	31 - 33	-

11.3 Исследование включало изучение комплекта из пяти имитационных каркасных тампонов (влажных губок), содержащих целевые микроорганизмы, в том числе серогруппы STEC O157 и O26, а также фоновую микрофлору (см. таблицу 3). При выборе имитационных каркасных тампонов в качестве матрицы для анализа руководствовались основными положениями (см. [19]).

Таблица 3 - Состав проб, исследованных в ходе межлабораторного испытания

Значения приведены в
Загрязняющая микрофлора и гены	Проба А	Проба В	Проба С	Проба D	Проба Е
STEC O157 stx1, stx2, eae	2		20	0	0
STEC O26 stx1, eae	0	40		40	0
Е. coli
К. pneumoniae
S. faecalis

В исследовании по определению Е. coli принимали участие 14 национальных референс-лабораторий (NRL). В ходе оценки эффективности данного метода при определении серогрупп STEC, отличных от серогруппы O157 (серогруппы O26) были получены следующие значения:

- Чувствительность (Se) - 100% (при доверительном интервале 95%, 96,97% - 100%);

- Специфичность (Sp) - 99,62% (при доверительном интервале 95%, 97,5% - 100%).

Результаты анализа, полученные в каждой национальной референс-лаборатории, принимавшей участие в исследовании, приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты обнаружения генов вирулентности и генов серогрупп в культурах после их обогащения методом ПЦР в режиме реального времени (часть метода анализа, проводившегося в ходе третьего совместного межлабораторного испытания)

Целевой ген

Проба

Лаборатории, принимавшие участие в исследовании

stx(a)

еае

Ген

серогруппы

O26

Ген

серогруппы

O111

Ген

серогруппы

О103

Ген

серогруппы

O145

(а) Данный ген может быть геном stx1 или stx2.

Национальные референс-лаборатории получили запрос, чтобы они также проводили выделение серогрупп STEC, отличных от серогруппы O157, которыми загрязнены пробы. Результаты данной процедуры приведены в таблице 5.

Таблица 5 - Выделение бактерий серогруппы STEC O26 из культур после их обогащения методом ПЦР в режиме реального времени (Подтверждение позитивных культур путем выделения инфекционных штаммов, проводившегося в ходе третьего совместного межлабораторного испытания)

Вид испытания

Проба

Истинное значение

Лаборатории, принимавшие участие в исследовании

Выделение серогруппы O26

Отчет, включающий всесторонний анализ результатов, полученных в ходе третьего совместного межлабораторного испытания, имеется в открытом доступе (см. [9]).

Расширенная неопределенность U, характеризующая концентрацию бактерий в инокуляте, равна для штаммов Е. coli (соответствующая информация приведена в [20]).

_____________________________

* XX - это серогруппа с искомыми генами.

** Серогруппа, выделенный штамм которой используют для обнаружения присутствия соответствующих генов или при помощи фенотипичного определения.

_____________________________

* См. приложение F.

_____________________________

* MilliQ является торговым наименованием продукции, поставляемой Millipore Corporation. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящим стандартом и не является рекламой ISO данной продукции. Допускается применение аналогичных продуктов, если доказано, что они обеспечивают получение сопоставимых результатов.

_____________________________

* TaqMan и Vic являются торговыми наименованиями продукции, поставляемой Applied Biosystems. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящим стандартом и не является рекламой ISO данной продукции. Допускается применение аналогичных продуктов, если доказано, что они обеспечивают получение сопоставимых результатов.

Библиография

[1]	Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) - Monitoring of verotoxigenic Escherichia coli (V TEC) and identification of human pathogenic V TEC types (Quest i on N о EFSA-Q-20 07-03 6). Eur. Food Saf. Author. J. 2007, (579), pp. 1 - 61
[2]	Nielsen, E.M., Andersen, M.T. Detection and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia coli by automated 5' nuclease PCR assay. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, pp. 2884 - 2893
[3]	Perelle, S., Dilasser, F., Grout, J., Fach, P. Detection by 5' nuclease PCR of Shiga-toxin producing Escherichia coli O26, О55, О91, O103, O111, О113, O145 and O157:H7, associated with the world's most frequent clinical cases. Mol. Cell Probes 2004, 18, pp. 185 - 192
[4]	Perelle, S., Dilasser, F., Grout, J., Fach, P. Detection of Escherichia coli serogroup O103 by realtime polymerase chain reaction. J. Appl. Microbiol. 2005, 98, pp. 1162 - 1168
[5]	Vimont, A., Delignette-Muller, M.L., Vernozy-Rozand, С. Supplementation of enrichment broths by novobiocin for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli from food: A controversial use. Lett. Appl. Microbiol. 2007, 44, pp. 326 - 331
[6]	Uemura, R., Sueyoshi, M., Nagayoshi, M., Nagatomo, H. Antimicrobial susceptibilities of Shiga toxinproducing Escherichia coli isolates from pigs with edema disease in Japan. Microbiol. Immunol. 2003, 47, pp. 57 - 61
[7]	Validation AFNOR des methodes alternatives d'analyse: Application a la microbiologie alimentaire [AFNOR validation of alternative analytical methods: Application to food microbiology]. Quimper: Adria Developpement. 56 p. Available (viewed 2012-10-17) at: http://www.afnor-validation.org/rapports-synthese/GENESYSTEMS/Synt%20GEN%2025-06%2011-08%20(fr).pdf
[8]	KagKli, d.-m, Weber, t.P., van den bulcKe, m., Folloni, s., tozzoli, г., morabito, s., ermolli, m.gribaldo, I., van den eede, g. Application of the modular approach to an in-house validation study of real-time PCR methods for the detection and serogroup determination of verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77, pp. 6954 - 6963
[9]	EUROPEAN UNION REFERENCE LABORATORY VTEC. Proficiency tests and ring trials on detection and typing methods. Rome: Istituto Superiore di Sanita. Available (viewed 2012-10-17) at: http://www.iss.it/vtec/neww/cont. php?id147&lang2&tipo15
[10]	SambrooK, J., Russel., D.W. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, 3 vols. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001
[11]	Paton, A.W., Paton, J.С. Detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stx1, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rf bO111, and r fbO157. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, pp. 598 - 602
[12]	O'Brien, A.D., NeWland, J.W., Miller, S.F., Holmes, R.K., Smith, H.W., Formal, S.B. Shiga-like toxinconverting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea. Science 1984, 226, pp. 694 - 696
[13]	Perna, N.T., PlunKett, iii, g., burland, v., mau, b., glasner, J.d., rose, d.J., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature 2001, 409, pp. 529 - 533
[14]	HoorFar, J., Malorny, В., AbdulmaWJood, A., CooK, N., Wagner, M., Fach, P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, pp. 1863 - 1868
[15]	Beutin, L., Jahn, S., Fach, P. Evaluation of the 'GeneDisc' real-time PCR system for detection of enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O26, O103, O111, O145 and O157 strains according to theirvirulence markers and their O- and H-antigen-associated genes. J. Appl. Microbiol. 2009, 106, pp. 1122 - 32
[16]	ISO 7550	Лабораторная посуда - Одноразовые микропипетки
[17]	ISO 16140:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Протокол валидации, альтернативные методы
[18]	ISO 16140-2	Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Проверка Способ - Часть 2: Протокол для проверки собственных методов против эталонного метода
[19]	ISO 16654*	Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения палочки Escherichia coli O157
[20]	ISO/TS 19036:2006 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие принципы для оценки погрешности измерения для количественных определений
[21]	ISO 20837	Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для обнаружения пищевых патогенов - Требования к подготовке образцов для качественного обнаружения
[22]	Scheutz, F., teel, l.d., beutin, I., Pierard, d., buvens, g., Karch, h., mellmann, a., caPrioli, a., tozzoli, г., morabito, s., strocKbine, n.a., melton-celsa, a.r, sanchez, m., Persson, s., o'brien, a.d. A multi-center evaluation of a sequencebased protocol to subtype Shiga toxins and standardize Stx nomenclature. J. Clin. Microbiol. 2012 Jul 3
[23]	National center For emerging and zoonotic inFectious diseases, division oF Foodborne, Waterborne, and environmental diseases. National Enteric Disease Sur veillance: Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) Annual Summary, 2009. Bethesda, MD: CDC, 2012
[24]	EuroPean Food saFety authority and euroPean centre For disease Prevention and control. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. Eur. Food Saf. Author. J. 2012, 10, p. 2597
[25]	EuroPean Food saFety authority. Technical specifications for the monitoring and reporting of verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) on animals and food (VTEC surveys on animals and food). Eur. Food Saf. Author. J. 2009, 7, p. 1366
[26]	Schmidt, h., scheeF, J., morabito, s., caPrioli, a., Wieler, l.h., Karch, h. A new Shiga toxin 2 variant (Stx2f) from Escherichia coli isolated from pigeons. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66, pp. 1205-8
[27]	Fricker, m., messelhusser, u., busch, u., scherer, s., ehling-schulz, m. Diagnostic real-time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 2007, 73, pp. 1892 - 1898

_____________________________

* Ввиду того, что на момент времени публикации ISO/TS 13136:2012 действовал только один ([19]), в котором приведен эталонный метод обнаружения серогруппы Е. Coli O157 в пищевых продуктах, рассматриваемый метод был валидирован и сертифицирован только в рамках валидации NF (см. [7]) в отношении обнаружения STEC только серогруппы O157.

В соответствии с данным исследованием часть метода, касающаяся серогруппы STEC O157, была сертифицирована AFNOR как эквивалентная методу, приведенному в международном стандарте [17] (номер сертификата - GEN 25/04-11/08). Исчерпывающая информация по валидации приведена в [7].

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.

Открыть документ

Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.

Приложение А (обязательное). Блок-схема процедуры проведения анализа

Приложение В (обязательное). Блок-схема процедуры выделения и подтверждения

Приложение D (справочное). Внутренний контроль амплификации

Приложение Е (справочное). Праймеры и зонды для ПЦР-анализа

Приложение F (обязательное). Выделение чистых штаммов STEC

Приложение ДА (справочное). Сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам

Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.