Приложение С (справочное). Идентификация Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин (STEC), путем выявления генов вирулентности мультиплексной ПЦР-амплификацией и обнаружение продуктов ПЦР путем электрофореза в агарозном геле

Приложение С
(справочное)

Идентификация Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин (STEC),
путем выявления генов вирулентности мультиплексной ПЦР-амплификацией и обнаружение продуктов ПЦР путем электрофореза в агарозном геле

С.1 Общие положения

STEC являются штаммами Escherichia coll, которые позволяют внедряться лизогенным бактериофагам, имеющим гены, кодирующие синтез Шига-токсинов (см. [12]). Метод, описанный в настоящем приложении, позволяет обнаружить с помощью мультиплексной ПЦР наличие STX-кодирующих генов в культурах Е. coli, принадлежащих к STEC. Проводят также определение наличия гена еае, поскольку он присутствует в штаммах STEC, вызывающих тяжелые заболевания человека.

Использование пар олигонуклеотидных праймеров stx1F/stx1R и stx2F/stx2R (см. [11]), позволяет обнаружить гены stx1 и stx2 соответственно. stx2F/stx2R позволяет обнаружить все варианты гена stx2, кроме stx2f. Тем не менее это не является существенным для здоровья населения, так как данный вид гена в основном присутствует в STEC, выделенных из птиц (см. [20]). Праймеры, используемые для обнаружения гена еае (см. [11]), способны распознавать все описанные в публикациях полиморфные варианты этого гена.

Примечание - Метод, приведенный в настоящем приложении, используют в отношении чистых бактериальных культур только для подтверждения принадлежности выделенных штаммов.

С.2 Сокращения

О.П.: отдельная проба.

С.3 Порядок проведения метода

С.3.1 Сущность метода

Метод основан на ПЦР-амплификации специфических областей ДНК из ДНК-матрицы, с олигонуклеотидами, вызывая начало реакции ПЦР.

Обнаружение stx1, stx2 и еае генов проводят с помощью мультиплексной ПЦР с использованием специфических праймеров (см. таблицу С.1). Метод состоит из следующих этапов:

- пробоподготовка;

- проведение ПЦР;

- визуализация продуктов ПЦР с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле.

С.3.2 Пробоподготовка

Полученные бактериальные культуры на твердых питательных средах, например на триптон-соевом агаре (TSA), обрабатывают следующим образом:

- отбирают одну колонию стерильной петлей, захватывающей объем 1 ;

- пробоподготовка осуществляется путем суспендирования бактерий в 100  стерилизованной воды, деионизированной путем фильтрации через фильтр milliQ* с диаметром пор 0,22 мкм, с последующим кипячением в течение 10 мин.

С.3.3 Проведение ПЦР

Для каждой пробы готовится отдельно 50  реакционной смеси, состоящей из реакционного буфера, MgCI2 в концентрации 1,2 , дезоксинуклиотидфосфатаз (dNTP) в концентрации 0,2 каждой, 50 пмоль каждого праймера, 2 единицы Taq-полимеразы и 10  ДНК-матрицы.

Объем реагентов зависит от конечного объема реакции. При проведении ПЦР-реакций используют деионизованную воду, указанную в С.3.2.

Проведение каждой ПЦР включает в себя положительный и два отрицательных контроля. ДНК-матрицу для положительного контроля получают из штамма E.coli, гарантированно содержащего гены вирулентности, в то время как отрицательным контролем служит ДНК-изолят от непатогенных штаммов E.coli (не несущих в своем геноме генов вирулентности), вторым отрицательным контролем служит реакционная смесь без добавления матричной ДНК.

Проведение реакции происходит в амплификаторе с запрограммированным тепловым профилем (см. [11] и таблицу С.1).

С.3.4 Электрофорез в агарозном геле

Готовят раствор агарозы в концентрации 20 в однократном трис/борат/ЭДТА (ТВЕ) или трис/этилацетат/ЭДТА (ТАЕ) буфере. Заполняют каждую лунку затвердевшего агарозного геля продуктами ПЦР в объеме 15 , смешанных с красителем. Электрофорез проводят в однократном буфере (ТВЕ или ТАЕ) при постоянном напряжении (100 V). Использование маркера молекулярного веса позволяет определить необходимые молекулярные массы полученных ампликонов (см. таблицу С.1).

Примечание - Правильное определение полос в агарозном геле, после проведения электрофореза, является важным моментом в оценке наличия генов вирулентности. Убедитесь, что полосы, полученные на положительном контроле, точно соответствуют определенной молекулярной массе.

В агарозный гель необходимо добавить бромистый этидий для визуализации продуктов ПЦР. При воздействии на данный реактив ультрафиолетового излучения он флуоресцирует красно-оранжевым цветом. Конечная концентрация бромистого этидия составляет 0,5  при добавлении перед заливкой агарозного геля в планшет для гель-электрофореза.

В качестве альтернативы допускается окрашивание агарозного геля после электрофореза в водном растворе этидий бромида концентрацией 0,5 .

С.3.5 Оборудование

Используют обычное оборудование, необходимое для микробиологической лаборатории (см. ISO 7218) и, в частности, следующее.

С.3.5.1 Ламинарный бокс для ПЦР.

С.3.5.2 Дозатор, вместимостью 1  стерильный.

С.3.5.3 Стерильные бактериологические петли.

С.3.5.4 Флаконы из боросиликатного стекла, вместимостью 500 .

С.3.5.5 Цилиндры из боросиликатного стекла, вместимостью 500 .

С.3.5.6 Цилиндры из боросиликатного стекла, вместимостью 1 .

С.3.5.7 Термостат, способный поддерживать температуру на уровне (37 1) °С.

С.3.5.8 Технические настольные весы.

С.3.5.9 Автоклав.

С.3.10 Устройство для раскапывания.

С.3.5.11 Микропипетки.

С.3.5.12 Наконечники для микропипеток, стерильные.

С.3.5.13 Микропробирки, вместимостью 1,5 .

С.3.5.14 Микропробирки для ПЦР, вместимостью 0,2 или 0,5 .

С.3.5.15 Амплификатор.

С.3.5.16 Магнитная мешалка.

С.3.5.17 Магнитное устройство для перемешивания.

С.3.5.18 Деионизатор воды.

С.3.5.19 Камера для электрофореза.

С.3.5.20 УФ-трансиллюминатор.

С.3.5.21 Льдогенератор.

С.3.5.22 Микроволновая печь.

С.3.6 Реактивы и среды

В ходе анализа, если не указано иное, используются реактивы ч.д.а. и стерильная дистиллированная или деминерализованная вода или вода эквивалентной чистоты.

С.3.6.1 Агар микробиологический.

С.3.6.2 Раствор dNTP.

С.3.6.3 Синтетические олигонуклеотидные праймеры.

С.3.6.4 Taq ДНК-полимераза и десятикратный реакционный буфер с или без .

С.3.6.5 Буфер для электрофореза.

С.3.6.6 Маркер молекулярного веса ДНК.

С.3.6.7 Краситель для внесения в продукты ПЦР.

С.3.6.8 Агароза.

С.3.6.9 Раствор этидия бромида или другой краситель ДНК в геле.

С.3.7 Безопасность и защитные устройства

Некоторые штаммы STEC могут инфицировать людей при очень низкой инфекционной дозе и могут вызвать серьезные заболевания. Были зарегистрированы случаи инфицирования в лаборатории. Поэтому, работая с STEC, требуются профессиональные навыки работы в лаборатории и использование защитных устройств. Этидия бромид является мутагенным и токсичным реагентом, поэтому им необходимо пользоваться соблюдая технику безопасности и применяя средства защиты (лабораторный халат и латексные перчатки). Ультрафиолетовое излучение может привести к повреждению глаз, в связи с этим является обязательным использование полиметилмета-крилатных щитов и защитных очков.

С.3.8 Штаммы микроорганизмов и контроли для ПЦР

В качестве положительного контроля используют STEC штаммы микроорганизмов несущие в своем геноме гены stx1, stx2 и гены еае. Примером может служить эталонный штамм E.coli O157 EDL933 (WDCM 00188, см. [12], [13]).

В качестве отрицательного контроля следует использовать любой штамм E.coli K12, например, MG1655.

Контроли для ПЦР получают, как указано в С.3.2. Контроли могут быть подготовлены заранее и хранится в аликвотах по 10 , готовых к использованию при температуре минус 20 °С в течение 8 мес.

С.3.9 Интерпретация результатов

Пробы, показывающие фрагменты амплификации ожидаемого размера (см. С.3.4 и в таблице С.1), считаются положительными на наличие в своем геноме целевых генов.

Необходимо включать положительные и отрицательные контроли в каждой реакции, давая положительные и отрицательные результаты, соответственно. Если контроли дают неоднозначные результаты, необходимо повторить всю процедуру анализа.

Проверка правильности ампликона с помощью прямого секвенирования или других подходящих способов можно считать излишним, так как этот метод предназначен для подтверждения штаммов, выделенных и уже подвергшихся ПЦР-анализу в режиме реального времени.

Подтверждение ампликонов (например, путем прямого секвенирования или путем анализа эндонуклеазы рестрикции) необходимо проводить при получении неоднозначных результатов.

Таблица С.1 - Олигонуклиотидные праймеры, получаемые фрагменты ожидаемого размера

Целевой ген	Название праймеров (см. [11])	Последовательность праймеров	Размер ампликонов, bp
eae	eaeAF	GAC CCG GCA CAA GCA TAA GC	384
	eaeAR	CCA CCT GCA GCA АСА AGA GG
stx1	stx1F	ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC	180
	stx1R	AGA ACG CCC ACT GAG АТС АТС
stx2 (группа)	stx2F	GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC	255
	stx2R	TCG CCA GTT АТС TGA CAT TCTG
Параметры амплификации (см. [11]): 35 циклов ПЦР, каждый из которых включает 1 мин денатурации при температуре 95 °С; 2 мин отжига при температуре 65 °С в течение первых 10 циклов, уменьшая температуру до 60 °С с 11 до 15 цикла (1 °С за цикл) и 1,5 мин относительного удлинения при температуре 7 °С, увеличивая до 2,5 мин с 25 до 35 цикла.