Приложение 2. Проведение реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

Приложение 2
к методическим указаниям
МУ 3.1.3490-17

Проведение реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

Подготовка сывороток

Материалы

1. Фермент, разрушающий неспецифические ингибиторы - RDE.

2. ФСБР - фосфатно-солевой буферный раствор.

3. Пробирки, пипетки.

4. Водяная баня.

Процедура

Сыворотки крови животных и людей содержат различные полисахариды, включающие сиаловые кислоты, которые могут прикрепляться к гемагглютинину вируса гриппа и затруднять связывание специфических в отношении гриппа гемагглютинирующих антител. Для удаления этих неспецифических ингибиторов гемагглютинации образцы сыворотки обрабатываются ферментом RDE, разрушающим сиаловые кислоты. Работа проводится в ламинарном боксе II класса биобезопасности.

1. Быстро разморозьте исследуемые сыворотки крови при +37°C на водяной бане. Сразу после разморозки поместите сыворотки в лед и держите на льду во время использования.

2. Добавьте 40 мкл образца сыворотки в пробирку.

3. Добавьте 120 мкл RDE в каждую пробирку.

4. Закройте пробирки пробками.

5. Выдерживайте на водяной бане при +37°C от 18 до 20 часов.

6. Затем поместите пробирки в водяную баню при +56°C на 30 минут.

7. Добавьте 240 мкл ФСБР, pH = 7,2 в каждую пробирку. Конечное разведение сыворотки имеет соотношение 1:10. Конечный объем мкл.

8. Оставьте на ночь при +4°C. Если необходимо более долгое хранение, заморозьте до -20°C или ниже.

Подготовка эритроцитов

Материалы

1. Кровь человека группы 0 или морской свинки в буфере Олсвера должна быть свежей. Для работы с некоторыми антигенами штаммов вируса гриппа могут быть использованы эритроциты петуха, индейки или лошади. Допустимо хранение эритроцитов при +4°C не более 1 недели.

2. Стерильная хлопковая марлевая салфетка.

3. Физиологический раствор с ФСБР (0,01 M ФСБР, pH = 7,2). Должен быть холодным. Хранить при температуре +4°C и держать на льду или при +4°C во время использования.

4. 70% этанол в деионизованной воде.

5. Конические центрифужные пробирки для отмывания эритроцитов.

6. Стерильные пипетки.

Примечание. 0,5% эритроциты готовятся в тот же день, когда тестируются сыворотки на неспецифические агглютинины, и могут храниться при +4°C для использования в РТГА на второй день. Остатки необходимо уничтожить в конце второго дня.

Процедура

1. Аккуратно наберите, используя пипетку объемом 10 мл, примерно 5 мл эритроцитов со дна колбы. Профильтруйте через стерильную хлопковую марлевую салфетку в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл.

2. Осторожно наполните коническую пробирку холодным ФСБР, закройте пробкой и слегка перемешайте, переворачивая пробирку.

3. Центрифугируйте при 1200 об./мин в течение 10 минут при +4°C.

4. Удалите надосадочную жидкость, используя пипетку объемом 10 мл. Будьте внимательны: не всколыхните осадок эритроцитов.

5. С осторожностью повторите промывку холодным ФСБР (пункты 2-4) еще два раза, чтобы всего было три промывки эритроцитов. Для предотвращения гемолиза всегда бережно обращайтесь с эритроцитами, держите ФСБР на льду при температуре +4°C и не промывайте эритроциты больше трех раз.

6. Удалите оставшийся супеpнатант при помощи микропипетки и храните уплотненные эритроциты на льду.

7. Приготовьте рабочую суспензию эритроцитов: добавьте 2,5 мл уплотненных эритроцитов к 247,5 мл холодного ФСБР в стеклянную колбу объемом 500 мл (сполосните колбу ФСБР перед использованием). Перемешайте с помощью вращательных движений.

8. Приготовьте раствор суспензии эритроцитов 1:100. Для этого добавьте 100 мкл эритроцитов к 9,9 мл холодного ФСБР в конической пробирке объемом 15 мл. Осторожно перемешайте, переворачивая пробирку.

9. Тщательно вымойте гемоцитометр 70% этанолом и протрите насухо бумагой для оптических стекол или мягкой тканью, не оставляющей ворса. Вымойте и просушите покровное стекло тем же способом и аккуратно положите его в гемоцитометр так, чтобы оно покрывало зону чувствительности счетчика.

10. Поместите 10 мкл разбавленных 1:100 эритроцитов в гемоцитометр, вставляя наконечник автоматической пипетки в канал и позволяя клеткам распределиться по счетной зоне. Будьте внимательны: не переполняйте канал.

11. Посчитайте эритроциты в каждом из 4 больших угловых квадратов в гемоцитометре.

12. Каждое большое поле содержит 16 маленьких полей. Обратите внимание, что предполагаемое число эритроцитов в одном большом поле составляет от 40 до 60 клеток. Если количество клеток в каждом большом поле <40, то добавьте еще уплотненных эритроцитов и посчитайте снова. Если количество клеток в каждом большом поле >70, то добавьте холодного ФСБР к суспензии эритроцитов и посчитайте снова. Если количество эритроцитов в больших полях отличается друг от друга более чем в 2 раза, то это указывает на неверную загрузку или плохое перемешивание эритроцитов, и, следовательно, необходимо провести процедуру повторно.

А. После подсчета эритроцитов сполосните гемоцитометр и покровное стекло 70% этанолом и протрите насухо.

В. Рассчитайте, какое количество холодного ФСБР необходимо добавить для получения 0,5% суспензии эритроцитов. Для этого используйте следующую формулу:

Пример:

1)	Количество эритроцитов в каждом большом угловом поле
	50
	48
	42
	40
2) мл
3) (281,25 мл) - (250 мл) = 31,25 мл ФСБР надо добавить к суспензии эритроцитов.

Адсорбция сывороток с эритроцитами для удаления неспецифических агглютининов

Присутствие неспецифических агглютининов в образцах сывороток может привести к ложноотрицательному результату в РТГА. Наличие неспецифических агглютининов можно обнаружить, если к разбавленной сыворотке добавить раствор эритроцитов. Если наблюдается гемагглютинация, то в этом случае сыворотка должна быть адсорбирована с эритроцитами перед тестированием в реакции торможения гемагглютинации.

Материалы

1. Эритроциты человек группы 0 или морской свинки.

2. Физиологический раствор с ФСБР (0,01 M ФСБР, pH = 7,2). Должен быть холодным. Хранить при температуре +4°C и во время использования держать на льду.

3. Образцы сывороток, обработанных RDE.

4. Полистироловый 96-луночный микропланшет с V-образным дном.

5. Стерильные пипетки.

6. Одноразовые наконечники для многоканальных пипеток.

7. Микроцентрифужные пробирки.

Тестирование неспецифических агглютининов
(работа в ламинарном боксе II класса биобезопасности!)

1. Разделите планшет с V-образным дном пополам, прочертив линию маркером со стойкими чернилами между рядами D и E. Лунки рядов A и E будут служить для внесения в них сывороток. Сыворотки из ряда A будут тестироваться между рядами A и D. Сыворотки из ряда E будут тестироваться между рядами E и H.

2. Добавьте 25 мкл холодного ФСБР в лунки от ряда B до ряда D (с B1-B10 до D1-D10) для сывороток, которые будут протестированы в планшете торможения гемагглютинации N 1, и в лунки от ряда F до ряда H (с F1-F10 до H1-H10) для сывороток, которые будут протестированы в планшете торможения гемагглютинации N 2.

3. Добавьте по 50 мкл каждой сыворотки в лунки A1-A10 и E1-E10, соответствующие пронумерованным колонкам. В каждом планшете будет содержаться 22 образца сывороток.

4. Произведите серию двукратных разведений, перенося 25 мкл сыворотки из первого ряда в последующие ряды. Другими словами, перенесите из A в B, из B в C и из C в D. Удалите 25 мкл после ряда D. Также перенесите 25 мкл из E в F, из F в G, из G в H. Удалите 25 мкл после ряда H.

5. Добавьте 25 мкл холодного ФСБР во все лунки, содержащие сыворотки; колонки 1-10.

6. Добавьте 50 мкл холодного ФСБР в колонку 12 на планшете в качестве контроля эритроцитов. Колонка 11 остается пустой.

7. Слегка постучите по планшету, чтобы сыворотки хорошо перемешались с ФСБР.

8. Добавьте 50 мкл 0,5% эритроцитов во все лунки, кроме 11-й колонки.

9. Слегка постучите по планшету для лучшего перемешивания.

10. Выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы эритроциты смогли осесть.

11. Наклоните планшет под углом от 45° до 60°. Осевшие эритроциты в колонке 12 должны "потечь", напоминая слезу, под воздействием гравитации. Дождитесь, пока эти эритроциты не перестанут течь, и после этого запишите, в каких сыворотках произошла агглютинация эритроцитов. Агглютинированные эритроциты не "текут" и не образуют капли наподобие слезы.

12. Образцы сывороток с агглютинированными эритроцитами в лунках с разведением сыворотки 1:20 или больше должны быть адсорбированы с эритроцитами до тестирования в РТГА. Если агглютинация наблюдается только в первой лунке - разведение сыворотки 1:10, - тогда адсорбция необязательна.

Адсорбция сывороток с эритроцитами
(работа в ламинарном боксе II класса биобезопасности!)

1. Смешайте в микроцентрифужной пробирке 100 мкл уплотненных эритроцитов с 400 мкл сыворотки, обработанной RDE.

2. Осторожно переверните, чтобы перемешать содержимое, и выдержите 30 минут при температуре +4°C.

3. Снова осторожно переверните и выдержите еще 30 минут при температуре +4°C.

4. Центрифугируйте в микроцентрифуге Эппендорф при 600 x g в течение 5 минут.

5. Аккуратно соберите сыворотку, не затрагивая эритроциты.

Определение титра гемагглютинина вируса гриппа

Материалы

1. 0,5% суспензия эритроцитов человека группы 0 или морской свинки в ФСБР.

2. Физиологический раствор с ФСБР (0,01 M ФСБР, pH = 7,2). ФСБР необходимо хранить при температуре +4°C.

3. Антиген вируса гриппа.

Примечание. Антиген вируса гриппа должен храниться при температуре -70°C в аликвотах одноразового использования. Быстро разморозьте антиген вируса незадолго до использования и положите на лед. После работы все остатки антигена вируса гриппа должны быть утилизированы. Никогда не используйте размороженный и повторно замороженный антиген вируса гриппа.

4. Полистироловый 96-луночный микропланшет с V-образным дном.

5. Стерильные пипетки, одноразовые наконечники для многоканальных пипеток.

Процедура

1. На V-образных планшетах подпишите названия двух антигенов вирусов, которые вы будете использовать в тесте. Каждый антиген вируса тестируется дважды.

2. Добавьте 50 мкл холодного ФСБР в лунки со 2 по 12 в рядах A и B для первого антигена и в лунки со 2-й по 12-ю в рядах D и E для второго антигена.

3. Добавьте 50 мкл холодного ФСБР во весь ряд H. Этот ряд будет выполнять функцию контроля эритроцитов.

4. Добавьте 100 мкл первого антигена для тестирования в лунки A1 и B1. Добавьте 100 мкл второго тестируемого антигена в лунки D1 и E1.

5. Проведите серию двукратных разведений, перенеся 50 мкл из первой лунки в каждую последующую до 12-й лунки. Из 12 лунки удалите 50 мкл.

6. Добавьте 50 мкл 0,5%-й суспензии эритроцитов во все лунки в рядах A, B, D, E и H на планшете.

7. Аккуратно постучите по планшету, чтобы перемешать содержимое.

8. Выдержите при комнатной температуре или при + 4° С в течение 30 минут.

9. Определите титры гемагглютининов, наклонив планшет под углом от 45° до 60°. Осевшие эритроциты в ряду H должны "потечь" и образовать каплю. Дождитесь, пока эти эритроциты не перестанут течь, после чего отметьте те лунки, в которых эритроциты образовали "пуговки" и потекли. Наибольшее разведение антигена, которое дает полную гемагглютинацию ("зонтик"), считается титром гемагглютинина.

10. Разведите антиген вируса в холодном ФСБР таким образом, чтобы приготовить рабочий раствор, содержащий 8 ГАЕ/50 мкл. Например, у Вас получился титр HA, равный 160. Разделите его на 8, получите 20. Следовательно, необходимо разбавить исходный вирусный антиген в 20 раз, т. е. смешать 1 часть антигена с 19 частями холодного ФСБР.

11. Убедитесь в том, что разведенный антиген содержит 8 ГАЕ на 50 мкл, проведя вторую реакцию гемагглютинации (РГА), как описано выше. Титр вирусного антигена должен равняться 8. Если у Вас получилось другое число, использовать этот рабочий раствор антигена нельзя!

12. Храните рабочее разведение антигена на льду и используйте в тот же день.

Примечание. Стандартное рабочее разведение вирусного антигена должно иметь титр HA, равный 8 ГАЕ в 50 мкл. Это то же самое, что и 4 ГАЕ в 25 мкл. При таком титре наблюдается гемагглютинация в первых четырех лунках при титровании антигена в РГА. Если полная гемагглютинация наблюдается в 5 лунках, антиген имеет титр 16 ГАЕ/50 мкл и тестовый антиген должен быть разбавлен в 2 раза. И наоборот, если гемагглютинация наблюдается только в 3 лунках, то антиген имеет титр 4 ГАЕ/50 мкл. В этом случае к рабочему разведению антигена надо добавить такой же объем исходного антигенного раствора, какой был взят вначале. Это удвоит концентрацию антигена в рабочем разведении, чтобы дать титр 8 ГАЕ/50 мкл. Если после 1-2 исправлений у вас так и не получился титр 8 ГАЕ/50 мкл, процедуру приготовления рабочего раствора антигена лучше повторить сначала с постановки реакции гемагглютинации.

Реакция торможения гемагглютинации (протокол)

Материалы

1. 0,5% суспензия эритроцитов в ФСБР.

2. Физиологический раствор с ФСБР (0,01 M ФСБР, pH = 7,2). ФСБР необходимо хранить при температуре +4°C.

3. Диагностикумы гриппозные сухие для РТГА (применять согласно инструкции изготовителя).

4. Вирус гриппа, инактивированный бета-пропиолактоном (BPL-антиген). Аликвоты аллантоисной или культуральной антигенсодержащей жидкости хранить при -70°С.

5. Образцы сывороток, обработанные RDE, тестированные на неспецифические агглютинины эритроцитов.

Примечание. Сыворотка должна быть заморожена один раз и храниться при температуре от -20 до -70°C.

6. Полистироловый 96-луночный микропланшет с V-образным дном. В каждом планшете может быть протестировано 11 образцов сывороток.

7. Стерильные пипетки.

8. Конические центрифужные пробирки для разведения антигена.

9. Одноразовые наконечники для многоканальных пипеток.

Процедура

1. Быстро разморозьте сыворотки на водяной бане при +37°C. Как только сыворотки растают, держите их на льду во время работы.

2. Пронумеруйте планшеты и подпишите названия двух тестируемых антигенов. Сыворотки тестируются в повторах на двух идентичных планшетах.

3. Добавьте 25 мкл холодного ФСБР в ряды от B до H (от B1-B11 до H1-H11).

4. Добавьте 50 мкл каждого образца сывороток в первую лунку (A1-A10).

5. Внесите 50 мкл положительного контроля в лунку А11 одного планшета и отрицательного контроля в лунку A11 второго планшета.

6. Проведите серию двукратных разведений, перемещая 25 мкл сыворотки из A1-11 в лунки последующих рядов. Последние 25 мкл сыворотки из ряда H утилизируйте.

7. Добавьте 25 мкл рабочего раствора антигена, содержащего 4 ГАЕ, в лунки, содержащие сыворотки. Обратите внимание на то, что это то же самое, что 50 мкл, содержащих 8 ГАЕ.

8. Аккуратно постучите по планшету, чтобы перемешать содержимое.

9. Выдержите при комнатной температуре в течение 30 минут.

10. Добавьте 50 мкл ФСБР в колонку 12, что послужит контролем эритроцитов.

11. Добавьте 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов в каждую лунку.

12. Аккуратно постучите по планшету, чтобы перемешать содержимое.

13. Выдержите при комнатной температуре или при + 4°С в течение 30 минут.

14. Результат оценивают через 30 минут инкубирования, наклонив планшет под углом от 45° до 60°C. Осевшие эритроциты в колонке 12 должны "потечь" и образовать каплю. Дождитесь, пока эти эритроциты не перестанут течь, после чего отметьте те лунки, в которых эритроциты образовали "пуговки" и потекли так же, как в 12-й колонке. Лунки, где произошло полное торможение гемагглютинации, будут выглядеть как контрольные.

Если произошло взаимодействие антиген/антитело, гемагглютинация эритроцитов будет ингибирована. Для записи данных следует пользоваться следующими знаками: знак "+" - для полной гемагглютинации ("зонтик"), знак "+/-" - для частичной гемагглютинации и знак "-" - для торможения гемагглютинации ("пуговка"). Титр в РТГА соответствует наибольшему разведению сыворотки, которое полностью тормозит гемагглютинацию (последняя "пуговка"). Необходимо внимательно следить за инкубацией. Если реакция проведена при комнатной температуре результат следует прочитать сразу после того, как эритроциты в контроле полностью осядут. Если реакция проведена при температуре +4°С результат можно прочитать в течение 0,5-1 часа после того, как эритроциты в контроле полностью осядут.

15. Титр сыворотки в РТГА - это разведение сыворотки в последней лунке с полным торможением гемагглютинации, например, 1:640. Обратный титр сыворотки - это величина, обратная титру, например, 640.