Приложение К (справочное). Методы измерения остаточного содержания этиленоксида

Приложение К
(справочное)

Методы
измерения остаточного содержания этиленоксида

К.1 Результаты межлабораторной оценки методов

К.1.1 Методы определения ЭО

Межлабораторная оценка ряда методов определения ЭО (см. [112], [113] и [114]) была проведена в 13 лабораториях с использованием серий образцов, содержащих ЭО от 40 до 350 мг/кг. Вычисленный общий коэффициент вариации изложенных методов представлен в таблице К.1.

Таблица К.1 - Сравнение коэффициентов вариации при внутри- и межлабораторном изучении методов

Определение ЭО	Межлабораторное изучение, %	Внутрилабораторное изучение, %
Метод равновесного пара	3,7	21,3
Метод с использованием ацетона	4,1	16,3
Метод с использованием DMF	2,9	8,3
Метод с использованием воды	2,7	17,0

При других межлабораторных испытаниях проведена оценка одного и того же метода определения ЭО (см. [89]). Данные линейной регрессии были получены при сравнении результатов двух лабораторий для серий образцов, содержащих ЭО от 3,6 до 26 мг/кг.

Рассчитанное уравнение регрессии y = 0,04 + 0,904х; коэффициент корреляции r = 0,974 (р < 0,00001). Рассчитанный коэффициент вариации метода при межлабораторном исследовании составлял 4,0 % при содержании ЭО в анализируемой матрице 14 мг/кг или 8,3 % при содержании ЭО 30 мг/кг (неопубликованные данные, представленные A. Nakamura, Н. Kikuchi и К. Tsuji). В двух лабораториях были получены данные анализа образцов с тремя различными содержаниями ЭО с использованием как метода экстракции растворителем с последующим анализом равновесной паровой фазы (см. [136]), так и метода бромирования (см. [89]). Результаты сравнивали, используя линейный регрессионный анализ. Были получены следующие характеристики регрессии: y = - 0,03 + 1,07х, коэффициент корреляции r = 0,999. При межлабораторном изучении методики, представленной в К.4.4, коэффициент вариации составлял 4,7 %; 1,8 % и 2,7 % при содержании ЭО в анализируемой матрице 12, 25 и 56 мг/кг соответственно [132].

К.1.2 Методы определения ЭХГ

Межлабораторную оценку проводили с использованием метода определения ЭХГ (см. [14]). Вычисленный коэффициент вариации был следующим:

- 7,46 % - при внутрилабораторном исследовании;

- 10,99 % - при межлабораторном исследовании.

Эти данные были получены для концентраций ЭХГ от 3,0 до 100 мг/кг.

К.2 Оборудование и реагенты

К.2.1 Оборудование

К.2.1.1 Газовый хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором FID или детектором электронного захвата ECD и регистрирующим устройством.

Примечание 1 - ECD не обнаружит ЭО, если он вначале не дериватизирован бромводородом.

Примечание 2 - Для получения воспроизводимых результатов предпочтительно использовать электронный интегратор.

К.2.1.2 Инъекционные иглы и трубки из поливинилхлорида, необходимые для приготовления контрольных растворов.

К.2.1.3 Мерная стеклянная посуда, снабженная пробками, покрытыми ПТФЭ, или прокладками из ПТФЭ, для приготовления контрольных растворов. Следует соблюдать меры предосторожности при выборе стеклянной посуды подходящей вместимости, с тем чтобы уменьшить пространство, занятое равновесным паром, над раствором экстракта или контрольным раствором. При приготовлении жидких контрольных растворов или экстрактов пространство, занятое равновесным паром, должно быть менее или равно 10 % объема экстракта или контрольного раствора.

К.2.1.4 Микрошприц (объемом 5 или 10 мкл) для ввода аликвот экстракта в газовый хроматограф.

К.2.1.5 Вытяжной шкаф для обеспечения соответствующей вентиляции при приготовлении контрольных и других растворов.

К.2.1.6 Аналитические весы, обеспечивающие взвешивание с погрешностью не более 0,1 мг.

К.2.1.7 Газовый регулятор для емкости, содержащей ЭО.

К.2.1.8 Газонепроницаемые шприцы объемом 10, 50, 100 и 1000 мкл для приготовления контрольных растворов и ввода равновесной паровой фазы в колонку газового хроматографа.

К.2.1.9 Лабораторный термошкаф для нагревания образцов до температуры (100  2) °С.

К.2.1.10 Лабораторный термошкаф для нагревания образцов до температуры (37  1) °С.

К.2.1.11 Водяная баня для термостатирования образцов при температуре (70  2) °С.

К.2.1.12 Механический встряхиватель.

К.2.1.13 Стеклянные емкости для проведения анализа методом равновесного пара, снабженные прокладками с покрытием из ПТФЭ, номинальным объемом 20 мл для приготовления контрольных растворов при построении калибровочного графика.

К.2.1.14 Емкость с плоским дном и завинчивающейся крышкой размером, позволяющим вместить образец и экстракционную жидкость, снабженная силиконовой прокладкой с покрытием из ПТФЭ и тонкой пленкой из ПТФЭ, которую используют для экстракции ЭО и реакции ЭО с бромгидрином, если применимо.

К.2.1.15 Инъекционная игла для ввода бромистоводородной кислоты диаметром 0,65 мм и длиной 25 мм.

К.2.1.16 Миллипоровый фильтр с порами размером 45 мкм для фильтрации реакционной смеси перед хроматографическим определением.

К.2.1.17 Холодильная камера для хранения образцов при температуре от 2 °С до 8 °С.

К.2.2 Реагенты

К.2.2.1 Эпоксиэтан (ЭО) в подходящем газовом баллоне; содержание основного вещества - 99,7 %.

К.2.2.2 2-Хлорэтанол (ЭХГ); 99 %-ная проба.

К.2.2.3 1,2-Эпоксипропан (пропиленоксид), реактив.

К.2.2.4 Свежеперегнанная (дважды) бромистоводородная кислота, приготовленная следующим образом.

Перегоняют 100 мл 47 %-ной бромистоводородной кислоты в присутствии 100 мг хлорида олова (II). Первые 25 мл дистиллята отбрасывают, а следующие 50 мл собирают. Вновь перегоняют 50 мл дистиллята в присутствии 50 мг хлорида олова (II), отбрасывают первые 15 мл дистиллята и собирают следующие 20 мл бесцветной жидкости (температура кипения от 125 °С до 126 °С). Хранят в стеклянном контейнере со стеклянной пробкой и используют в течение недели.

К.2.2.5 Хлорид олова (II) (двухлористое олово), реактив.

К.2.2.6 Вода, пригодная для газовой хроматографии по степени чистоты.

К.2.2.7 Этиловый спирт, пригодный для газовой хроматографии по степени чистоты.

К.2.2.8 Пропанон (ацетон), пригодный для газовой хроматографии по степени чистоты.

К.2.2.9 Диметилформамид (ДМФА), пригодный для газовой хроматографии по степени чистоты.

К.3 Приготовление контрольных растворов

К.3.1 Приготовление контрольных растворов ЭО

Соответствующие контрольные растворы готовят методом, изложенным в J.1.

К.3.2 Приготовление контрольных растворов ЭХГ

Контрольные растворы ЭХГ готовят методом, изложенным в J.2.

К.3.3 Приготовление контрольных растворов пропиленоксида (ПО)

Готовят контрольные растворы растворением ПО в этиловом спирте таким образом, чтобы получить раствор концентрацией 0,5 мкг/мл.

К.4 Экстракция из изделий

К.4.1 Общие положения

Готовят экстракты в соответствии с указаниями, представленными в 4.4.

К.4.2 Экстракция, моделирующая условия применения изделия

Для моделирования условий применения изделия в медицинской практике применяют воду. Осуществляют экстракцию в условиях, представляющих наибольшую нагрузку при предназначенном использовании.

Например, выполняют экстрагирование из изделий, контактирующих с кровью, и парентеральных изделий водой путем их полного заполнения или промывания тех каналов, по которым протекает кровь или жидкость (подходит любой метод).

Примечание - При полном заполнении необходимо убедиться в том, что отсутствуют пустоты.

Когда невозможно заполнить составные части изделия, контактирующие с пациентом, помещают все изделие или основной и репрезентативный фрагмент изделия в подходящий контейнер и добавляют воду, соблюдая нужное соотношение образец/модельная среда. Для того чтобы убедиться в достоверности данных, полученных при анализе небольших образцов изделий большого размера, отбирают несколько представительных фрагментов изделия.

Образцы подвергают экстракции в течение времени, равного или превышающего наибольшее время контакта изделия с пациентом при однократном применении, и выбирают температуру экстракции, которая предоставит наибольшую моделированную нагрузку в соответствии с п. 4.4.6.2. В качестве альтернативного метода готовят серию экстрактов (рекомендуется как минимум три), соответствующих нескольким более коротким периодам времени, и используют скорость экстракции для вычисления влияния при более длительном или многократном воздействии.

Если анализ не проводят сразу, декантируют экстракт во флакон и хранят, закрыв пробкой с прокладкой, покрытой ПТФЭ. Пространство, занятое равновесным паром, во флаконе с контрольным раствором или экстрактом должно быть менее 10 % общего объема. Экстракт хранят в холодильной камере при температуре (5  3) °С. Исследователь должен установить срок годности и хранения. Когда для определения ЭО используют водные экстракты, соблюдают меры предосторожности, так как в процессе хранения водного экстракта [35], ЭО может превратиться в ЭГ или ЭХГ, или в оба этих продукта.

К.4.3 Методика исчерпывающей экстракции при повышенной температуре

Взвешивают 1 г образца с погрешностью 0,1 мг и помещают его во флакон с пробкой. Помещают герметично закрытый флакон в термошкаф, нагретый до подходящей температуры, и термостатируют в течение подходящего периода времени. Режим времени и температуры относительно произволен. Варьируют время для достижения равновесия парциального давления ЭО с паровой фазой.

Вынимают флакон из термошкафа. Вводят 100 мкл пробы равновесной паровой фазы в колонку хроматографа (анализ повторяют дважды) и определяют высоты и площади пиков, соответствующих ЭО. Рассчитывают среднее значение для двух измерений.

Примечание - Следует быть осторожным. При введении пробы игла не должна соприкасаться с наполнителем колонки. Опыт показал, что анализ горячих образцов сразу после того, как они были удалены из термошкафа, часто приводит к ошибке более 20 % из-за потери материала в шприце, так как при удалении шприца из флакона давление в шприце уравновешивается с атмосферным давлением. Некоторые материалы ресорбируют ЭО во время уравновешивания их температуры с комнатной. Существуют также некоторые материалы, которые полностью ресорбируют ЭО при охлаждении. При проведении анализа таких материалов может оказаться необходимым вводить исследуемые образцы и контрольные растворы в колонку хроматографа, пока они еще горячие или теплые, а затем прокачать шприц (как описано выше) без дальнейшего охлаждения.

Коммерчески доступны автоматизированные анализаторы равновесной паровой фазы. Тем не менее эту процедуру можно выполнить вручную.

Используя вытяжной шкаф, удаляют крышку с флакона и продувают его в течение 30 с сухим азотом. Используя новую мембрану, снова закатывают крышку и повторяют нагревание и ввод пробы до полного извлечения ЭО. Полное извлечение достигается, когда экстрагируемое количество ЭО составляет менее 10 % полученного при первой экстракции или когда нет аналитически значимого увеличения в обнаруженных кумулятивных уровнях осадка. С использованием калибровочного графика рассчитывают количество ЭО в образце, суммируя количества ЭО, полученные для средних значений измерений площадей или высот пиков при каждом из нескольких нагреваний образца.

К.4.4 Исчерпывающая экстракция этиловым спиртом с последующим анализом этанольных экстрактов методом равновесной паровой фазы

К.4.4.1 Контрольные растворы для построения калибровочного графика

Готовят контрольные растворы, разбавляя ЭО в этиловом спирте таким образом, чтобы получить растворы с концентрацией ЭО 0,4; 0,8; 1,2; 1,6 и 2 мкг/мл. Готовят контрольный раствор ПО в этиловом спирте концентрацией 0,5 мкг/мл в соответствии с К.3.3. Охлаждают эти растворы и соответствующее число специальных флаконов для анализа методом равновесной паровой фазы (см. рисунок К.1) в бане, заполненной смесью сухого льда с изопропанолом, или аналогичным образом. Переносят соответствующие аликвоты каждого контрольного раствора ЭО и те же самые объемы контрольного раствора ПО во флаконы для проведения анализа методом равновесной паровой фазы. Флаконы термостатируют при температуре 70 °С в течение 30 мин и вводят от 100 мкл до 1 мл аликвот равновесной паровой фазы из каждого флакона в колонку газового хроматографа (анализ проводят дважды). Чтобы получить калибровочный график, измеряют высоты или площади пиков ЭО и ПО и строят зависимость отношения высот или площадей пиков (ось X) от концентрации ЭО.

Добавление ПО к контрольным растворам ЭО используют как внутренний стандарт для оценки точности приготовления контрольных растворов ЭО. Построение соотношения ЭО/ПО против намеченных концентраций ЭО в контрольных растворах в идеале приведет к коэффициенту линейной корреляции r, составляющему 1,000, и линейному уравнению y = 0,5х + 0. Такие параметры обозначают абсолютно прямую калибровочную линию, которая имеет наклон в 0,5 с нулевой точкой пересечения с осью Y. Можно использовать коэффициент корреляции в 0,999 или лучше. Линейный наклон выше 0,5 с нулевой точкой пересечения с осью Y означает, что все контрольные растворы ЭО были ниже, чем намеченные концентрации. Наклон менее чем 0,5 с нулевой точкой пересечения с осью Y означает, что все контрольные растворы ЭО были выше, чем намечено. Следует обратить внимание, что калибровочные линии с точкой пересечения с осью Y выше или ниже нуля приведут к результатам образца ЭО, которые выше или ниже, чем реальная концентрация, соответственно, особенно при более низких результатах образца ЭО. Степень неточности зависит от расстояния оси Y от нуля. Наконец, высота или площадь самого пика ЭО должна оставаться относительно постоянной. Флуктуация высоты или площади пика ЭО означает вариативность объема инъекции образца в ГХ. Тем не менее это не должно стать проблемой при современном уровне технологии ГХ.

1 - жидкость; 2 - О-образное кольцо; 3 - самоуплотняющаяся мембрана; 4 - равновесная паровая фаза; 5 - зажим

Рисунок К.1 - Специальный флакон для проведения анализа методом равновесной паровой фазы

К.4.4.2 Методика анализа

Взвешивают 5 (или 0,5) г исследуемого образца, разрезанного на небольшие кусочки (длиной 5 мм для трубок, площадью 10 мм² для пластин), с погрешностью до 0,1 мг и помещают во флакон объемом 100 (или 10) мл для проведения анализа методом равновесной паровой фазы. Добавляют во флакон 50 (или 5) мл контрольного раствора ПО (0,25 мкг/мл). Закрывают флакон, закатывают крышку и термостатируют герметично закрытый флакон при температуре 70 °С в течение 3 ч с легким встряхиванием. Вводят от 100 мкл до 1 мл равновесной паровой фазы в колонку газового хроматографа и определяют отношения параметров пиков ЭО/ПО (определение повторяют дважды). Используя калибровочный график, описанный в К.4.4.1, вычисляют среднее содержание ЭО для двух параллельных образцов.

К.4.5 Исчерпывающая экстракция с использованием растворителя

Взвешивают около 1 г образца изделия и помещают в мерную стеклянную посуду с крышкой такой вместимости, чтобы объем равновесной паровой фазы был минимален. С помощью пипетки добавляют в мерную колбу 10 мл выбранного растворителя. Закрывают колбу и оставляют при температуре (25  2) °С на 24 ч.

Эти значения температуры и времени использовались в исследовании Марлоу [112], [113], [114]. Могут потребоваться другие утвержденные значения времени и температур для достижения исчерпывающей экстракции (см. К.4.3). Вводят аликвоты от 1 до 5 мкл в колонку хроматографа (анализ повторяют дважды). Вычисляют содержание ЭО в образцах, используя калибровочный график, и рассчитывают среднее значение для двух анализов.

К.4.6 Исчерпывающая экстракция этиловым спиртом с последующим получением бромгидринового производного и газохроматографическим определением с использованием ECD

К.4.6.1 Контрольные растворы для построения калибровочного графика

Готовят контрольные растворы, растворяя ЭО в этиловом спирте, чтобы получить растворы, содержащие ЭО в концентрациях 0,4; 0,8; 1,2; 1,6 и 2 мкг/мл. Готовят контрольный раствор, содержащий ПО в этиловом спирте с концентрацией 0,5 мкг/мл, в соответствии с К.3.3. Готовят контрольные смеси, смешивая равные объемы каждого контрольного раствора ЭО и контрольного раствора ПО. Это построение выполняют по той же причине, что и построение соотношения ЭО/ПО по сравнению с концентрациями контрольных растворов ЭО, как описано в К.4.4.1.

Переносят 1 мл каждой смеси во флакон с завинчивающейся крышкой. Добавляют две капли (около 0,015 г) бромистоводородной кислоты к смеси через мембрану с помощью инъекционной иглы. Оставляют флакон при комнатной температуре на 1 ч. Нагревают флакон в течение 1 ч при температуре 50 °С на водяной бане с легким перемешиванием, затем охлаждают до комнатной температуры.

Добавляют 0,02 г бикарбоната натрия во флакон и перемешивают путем встряхивания в вертикальном направлении в течение 30 мин. Оставляют флакон стоять на 10 мин. Встряхивают флакон в горизонтальном направлении в течение 30 мин. Оставляют флакон стоять на 10 мин, а затем центрифугируют с частотой вращения 3000 об/мин (50 s^-1) в течение 5 мин. Фильтруют смесь через миллипоровый фильтр.*

------------------------------

* Использование емкостей с U- или V-образной формой дна иногда вызывает неполную нейтрализацию, что приводит к плохим хроматограммам.

Для того чтобы получить значения отношений высоты пика этиленбромгидрина (ЭБГ) и пропиленбромгидрина (ПБГ), вводят от 1 до 5 мкл аликвоты каждого фильтрата в колонку газового хроматографа (определение повторяют дважды).

К.4.6.2 Процедура анализа

Вычисляют среднее двух образцов и определяют ЭО в образце согласно калибровочной линии, описанной в К.4.4.1.

Так как некоторые изделия медицинских материалов могут содержать ионы бромида (например, бутилированные резины), существует потенциал для формирования ЭБГ как продукта деградации ЭО, сходного с формированием ЭХГ из-за присутствия ионов хлора. Таким образом, порция образца должна быть проанализирована на предмет присутствия ЭБГ в качестве осадка стерилизации до приготовления производного бромгидрина.

К.4.7 Экстракция этиленхлоргидрина с использованием воды, моделирующая применение изделий

Используют процедуру, описанную в К.4.2.

К.4.8 Исчерпывающая экстракция этиленхлоргидрина с использованием воды

Взвешивают от 1 до 50 г фрагмента образца (или целый образец) и помещают в стеклянную посуду с пробкой такой вместимости, чтобы объем равновесной паровой фазы был минимален. Вводят воду в достаточных количествах для покрытия образца в контейнер и закрывают. Оставляют на 24 ч при температуре (25  2) °С. Энергично перемешивают контейнер с содержимым в механической мешалке приблизительно 10 мин.**

------------------------------

** Эти температуры и периоды времени использовались в референтной оценке (AAMI, 1989 [14]). Для достижения исчерпывающей экстракции могут потребоваться другие значения температуры и времени (см. К.4.3). Возможно потребуется энергичное встряхивание в течение всего периода времени. Некоторым материалам встряхивание может не понадобиться.

Вводят от 1 до 5 мкл пробы в колонку газового хроматографа. Рассчитывают концентрацию ЭХГ в образце по относительной площади пика или высоте пика, используя предварительно построенный калибровочный график.

К.5 Газовая хроматография

К.5.1 Общие положения

Выбирают наиболее пригодные методы и процедуры. Используют подходящую хроматографическую процедуру, которая удовлетворяет требования, приведенные в приложении А.

Может потребоваться оптимизация условий.

Примечание - Для улучшения точности измерения и для обнаружения проблем с инъекцией многие хроматографисты используют внутренние стандарты в своих процедурах.

К.5.2 Экстракция, моделирующая условия применения изделия для определения ЭО или ЭХГ

Вводят от 1 до 5 мкл аликвот водного экстракта, приведенного в К.4.2 или К.4.7.

К.5.3 Методика исчерпывающей экстракции при повышенной температуре

Вводят от 100 мкл до 1 мл аликвот равновесной паровой фазы.

К.5.4 Исчерпывающая экстракция этиловым спиртом с последующим анализом методом равновесной паровой фазы этанольного экстракта

Вводят от 100 мкл до 1 мл аликвот водного экстракта, приведенного в К.4.4.

К.5.5 Исчерпывающая экстракция этиловым спиртом с последующим приготовлением бромгидринового производного и определением методом газовой хроматографии с детектором ECD

Вводят от 1 до 5 мкл аликвот водного экстракта, приведенного в К.4.6.