Методические указания по патоморфологической диагностике болезней животных, птиц и рыб в ветеринарных лабораториях (утв. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ 11 сентября 2000 г. N 13-7-2/2137)

1. Общие положения

Патологическая морфология, как метод исследования в ветеринарной лаборатории занимает особое место. Во-первых, только патоморфология устанавливает развитие общепатологических процессов (дистрофии, воспаления, расстройства кровообращения, процессы регенерации, развитие опухолей, пороки, уродства и др.). Во-вторых, патолого-анатомическое исследование трупов или внутренних органов - это начальный этап в цепи последующих исследований (бактериологических, вирусологических, биохимических, токсикологических и др.), в комплексе с ними позволяет достоверно диагностировать многие болезни, а с использованием гистологического метода - около 40 болезней животных и птиц, что обусловлено "Методическими указаниями по проведению обязательного минимума исследований в ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных", утв. ГУВ МСХ СССР 24.06.1971 г., другими нормативными документами.

В ветеринарную лабораторию направляют трупы, внутренние органы целиком или частью (обобщенное название "патологический материал", "патматериал") для исследования с целью определения, установления причин заболевания или гибели животных, птицы и рыбы при подозрении на инфекционную, инвазионную болезнь, отравление или нарушение обмена веществ.

Патолого-анатомическое исследование проводят в специальном помещении, вскрывочной. Общая площадь вскрывочной должна быть не менее 20 , с хорошей освещенностью, вентиляцией, с непроницаемыми полами. Вскрывочная оборудуется водопроводом с кранами для холодной и горячей воды, канализацией. Устанавливаются 1-2 стола из нержавейки или иного материала для вскрытия. Основное требование, чтобы столы можно мыть и дезинфицировать. Помещение вскрывочной оснащают бактерицидными лампами, холодильной камерой (шкафом), создают запас дезинфицирующих средств.

Патолого-анатомическое исследование проводят с соблюдением мер личной профилактики. В распоряжении патологоанатома (вскрывающего) должен быть необходимый набор спецодежды (халат), спец. обуви (сапоги резиновые, калоши или др.), предметов спец. защиты (клеенчатый фартук, клеенчатые нарукавники, колпак или косынка, анатомические или хирургические перчатки, защитные очки, маска). На случай поступления патматериала, зараженного возбудителями II группы (по медицинской классификации), должно быть предусмотрено наличие защитного костюма типа "Кварц". Для дезинфекции рук, одежды, инструментов должны быть всегда свежеприготовленные дезрастворы, а также туалетное и хозяйственное мыло, полотенце. Необходимо иметь аптечку с настойкой йода, бактерицидным пластырем, клеем БФ-2, перевязочным материалом и др. В случае травмы (ранения) рук вскрытие следует немедленно прекратить, из ранки выжать как можно больше крови, ранку продезинфицировать (настойкой йода, спиртовым раствором бриллиантовой зелени или др.), заклеить (коллодием, целлоидином, клеем БФ-2, лейкопластырем или др.), при необходимости наложить повязку. Затем надевают другие перчатки и продолжают вскрытие.

2. Методы вскрытия трупов животных, птиц и рыб

Существует два основных метода вскрытия:

а) метод полной эвисцерации, когда органы шеи, грудной, брюшной и тазовой полостей выделяются из трупа целиком, без рассечения, в виде одного анатомического комплекса;

б) метод частичного рассечения анатомо-физиологических систем (отдельно органы дыхания, желудочно-кишечный тракт, паренхиматозные органы и т.д.).

Первый метод применяют в основном при вскрытии мелких, а второй - крупных животных. Иногда исследования органов проводят на месте их анатомического расположения.

Последовательность вскрытия полостей, выделения и исследования органов определяет вскрывающий в каждом конкретном случае в зависимости от анамнестических данных, анатомо-физиологических особенностей животного, результатов предварительного осмотра трупа и др. Соблюдается следующая последовательность вскрытия трупа:

- Наружный осмотр. Обращают внимание на положение трупа, выраженность трупного окоченения, состояние наружных покровов, естественных отверстий, видимых слизистых оболочек, наружных половых органов, состояние подкожной клетчатки, скелетной мускулатуры, поверхностных лимфоузлов. Определяют пол, породу, масть, отметины, размеры, примерный возраст, упитанность. Затем устанавливают выраженность трупных изменений (охлаждение, трупное окоченение, трупные пятна, трупное разложение).

- Внутренний осмотр. Трупу придают определенное положение, в зависимости от вида животного и его размеров. Мелких животных вскрывают в спинном, крупных - в полубоковом или боковом положении. Перед вскрытием брюшной полости у самок отделяют молочную железу, у самцов - наружные половые органы.

Трупы лошадей вскрывают в правом боковом положении, учитывая, что толстый отдел кишечника расположен преимущественно в правой половине брюшной полости. Вскрытие начинают с отделения левых грудной и тазовой конечностей. Разрезают кожу и брюшную стенку по белой линии, другой разрез - поперечный вдоль реберной дуги или перпендикулярно до поясничных мышц. Обращают внимание на содержимое брюшной полости, положение органов, вздутие кишечника и др. Отделяют мышцы от грудной клетки и делают два распила ребер: один на границе с головками ребер и второй отступив 5-6 см от грудной кости. Отделяют всю левую грудную стенку. Обращают внимание на содержимое грудной полости, положение органов и др. Для вскрытия ротовой полости удаляют нижнюю челюсть.

Дальнейшее патолого-анатомическое исследование проводят по общепринятой схеме.

Трупы крупного рогатого скота вскрывают в левом боковом или полубоковом положении, учитывая, что объемистый рубец находится в левой половине брюшной полости. Вскрытие брюшной и грудной полостей производят так же, как у лошади.

Трупы свиней вскрывают в спинном положении. Вскрывают и осматривают брюшную, грудную и ротовую полости, далее по общепринятой схеме.

Трупы собак, кошек, пушных зверей вскрывают в спинном положении.

Трупы птицы вскрывают в спинном положении. Проводят внешний осмотр, обращают внимание на пол, возраст, размеры тела и вес, упитанность, телосложение, состояние оперения, состояние слизистых оболочек и др.

Возраст у птиц определить бывает трудно. Обычно о нем судят по оперению, так как рост пера подчиняется определенному ритму, отставание в развитии птицы не препятствует росту пера. По этому признаку возраст у птицы можно определить с большой точностью.

Таблица N 1

Развитие оперения в зависимости от возраста цыплят

Состояние оперения	Возраст (дней)
Тушка покрыта эмбриональным пухом, в крыльях насчитывается 3-5 перьев	1-3
Крылья доходят до хвоста	8
Оперяются плечи	8-12
Появляются перья по обе стороны груди	13-16
Оперяется спина, и появляются перья на загривке и голени. Хвост поднимается кверху	21
Оперяется задняя сторона шеи, вырастают маховые перья первого порядка	35
Оперяются голова и нижняя часть туловища	42

После седьмой недели жизни точно возраст определяют по смене маховых перьев.

В крыле десять маховых перьев первого порядка. Через каждые две недели последовательно выпадает одно маховое перо, начиная с внутреннего.

Можно также использовать характерные отличительные признаки молодых и взрослых птиц.

Таблица 2

Основные отличительные признаки молодых и взрослых птиц

До одного года	Старше одного года
Клюв: мягкий, рог светлый	Твердый, рог темный.
Когти: мягкие, короткие, остроугловатые	Твердые, длинные, по краям закругленные.
Кожа: тонкая, нежная, белая, особенно под крыльями и на внутренней поверхности бедер	Толстая, грубая, желтоватая, особенно у птиц старше 2 лет.
Чешуя ног: гладкая, блестящая	Шероховатая, у птиц старше 2 лет желтоватая.
Кольца трахеи: легко сдавливаются	Кости твердые, негибкие, неподвижные (особенно у водоплавающей птицы).
Гребень: тонкий, гладкий, к 11-12 мес. полностью развит	Толстый, шероховато-бугристый, окрашен несколько бледнее, с лёгким синеватым оттенком.
Шпоры у петуха: до 5 мес. едва заметные, к 7 мес. достигают в длину 3 мм (без ороговевшего конца)	Длинные (до 10 мм), с ороговевшим концом. После 2 лет достигают 27 мм и изогнуты кверху.
Перья: (утка, гусь) нежные, пух исчезает после 2,5 мес.	Грубые.
Ногти: (индейка) чёрные	В два года - серо-чёрные, в 3 года - розово-красные.

Следует обращать внимание на состояние кожи и кожных образований. Проверяют наличие кровоизлияний, сыпи, новообразований, ранений и др. Местные припухлости кожи могут быть связаны с развитием опухолей, что имеет диагностическое значение.

Для вскрытия грудобрюшной полости удаляют перо и пух с шеи, груди и живота, обнаженную поверхность кожи смачивают водой или дезинфицирующей жидкостью для того, чтобы мелкий пух и перо не прилипали к коже и не разлетались в воздухе. Делают разрез кожи по средней линии от подклювья до ануса и осторожно снимают кожу по обе стороны от разреза. Отпрепаровывают кожу с конечностей, предварительно сделав к ним перпендикулярные разрезы от белой линии. Взяв рукой за конечности, вылущивают бедренную кость из тазобедренного сустава с одной и другой стороны. Теперь труп будет лежать в спинном положении без дополнительной фиксации. Разрезают брюшные мышцы от конца грудной кости до ануса. Затем от конца грудной кости ножницами вправо и влево делают разрез до подреберья. Отделяют грудную кость, глубоко подрезая грудные мышцы, отростки грудной кости, стернальные ребра, каракоидную кость и ключицу.

Осмотр органов производят по общепринятой схеме.

Патолого-анатомическое исследование рыбы имеет важное диагностическое значение при большинстве болезней. Для вскрытия отбирают свежие трупы (жабры без признаков разложения) или живых больных рыб. В последнем случае рыбу обездвиживают: усыпляют гипнодилом (5-10 мг/л), хлоралгидратом (2-4 мг/л); разрушают спинной мозг иглой или разрезом позвоночника в области затылка.

Патологоанатомическое исследование рыбы начинают с наружного осмотра, обращая внимание на состояние внешних покровов, плавников, глаз и др. Удаляют жаберные крышки, обнажают жабры. Отмечают изменение их окраски, рисунка, наличие кровоизлияний, очагов некроза, цист паразитов и т.д. Ножницами отрезают 2-3 дужки и просматривают под лупой. При необходимости отдельные лепестки исследуют под микроскопом, для чего их помещают на предметное стекло, накрывают покровным. Определяют толщину складок, выявляют патологические изменения жабер. Брюшную полость рыб вскрывают путем разреза брюшной стенки по белой линии впереди от анального отверстия до области межчелюстного пространства. Вторым полулунным разрезом, проходящим по уровню боковой линии, отсекают брюшную стенку, обнажая внутренние органы.

Осматривают брюшную и сердечную полости, обращая внимание на расположение органов, наличие жидкости, ее количество, цвет, запах, консистенцию, или газа, паразитов, внешний вид внутренних органов. У половозрастных особей отделяют гонады, отмечая при этом имеющуюся патологию: цвет, кровоизлияния, наличие мертвых икринок и др. Затем надрезают кишечник в области псевдодиафрагмы и ануса и извлекают весь комплекс внутренних органов. Отделяют желудок, кишечник, печень с желчным пузырем, селезенку. Отделяют плавательный пузырь и осматривают почки. Отмечают их размеры, консистенцию, цвет, кровенаполнение, наличие кровоизлияний, очагов некроза, рисунок на разрезе и др. Кишечник вскрывают, промывают в воде и просматривают состояние слизистой, учитывают количество гельминтов и др. При осмотре сердца отмечают размер, форму, состояние миокарда, степень наполнения полостей кровью, ее свертываемость, наличие сгустков, кровоизлияний. При осмотре плавательного пузыря отмечают форму, толщину и прозрачность оболочек, наличие кровоизлияний, пятен гемосидерина, экссудата или гноя в полости и т.д.

Черепную коробку вскрывают с помощью четырех разрезов: два боковых проходят от носовых ямок до затылочной области, третьим отсекают крышку у носовых ямок, четвертым - в области затылка. Осматривают оболочки головного мозга, характеризуют состояние вещества мозга.

При осмотре скелетной мускулатуры обращают внимание на цвет, консистенцию, наличие кровоизлияний, отеков, припухлостей, цист паразитов и др.

Результаты патолого-анатомического исследования вместе с клиническими симптомами составляют комплекс признаков, на основании которых устанавливают диагноз, непосредственную причину заболевания и гибели рыб. В сомнительных случаях данные патолого-анатомического исследования уточняют гистологическим исследованием патматериала.

2.1. Протоколирование вскрытия. Это письменное изложение всех тех отклонений от нормы или изменений, которые были отмечены при наружном осмотре трупа, вскрытии полостей и исследовании органов, равным образом - при исследовании отдельно представленных внутренних органов или их частей (кусочков), объединенных термином "патматериал". Записи должны быть точными и объективными.

Письменное изложение результатов патолого-анатомического исследования ведут в форме протоколов (можно использовать готовые бланки) или в форме отдельной записи. При вскрытии теленка, подсвинка, овцы, трупа животных других видов или отдельных птиц, доставленных в лабораторию для исследования, протокольные записи делают по каждому вскрытию, отдельной экспертизой. Если в лабораторию доставляют несколько поросят, щенков зверей, взрослых птиц или молодняк для одних и тех же целей исследования (отравление, подозрение на инфекцию и др.), протокольную запись можно делать одну на всю группу с указанием количества трупов или убитых животных, количества экспертиз (например, эксп. N 1-7). При этом всю группу условно нумеруют, отмечают схожие патолого-анатомические изменения или какие-либо особенности у отдельных трупов.

2.2. Правила отбора и доставки патологического материала для гистологического исследования. Для гистологического исследования отбирают кусочки печени, почек, селезенки, легких, сердца, лимфоузлы, участки кишечника. Для диагностики ряда заболеваний пробы отбирают из головного мозга, других тканей.

Патматериал отбирают от свежих трупов или убитых животных. Из разных участков патологически измененных органов (тканей) вырезают небольшие кусочки толщиной не более 2 см (в лаборатории из них вырезают кусочки не толще 1 см). Вместе с пораженной захватывают и непораженную ткань. Выбор направления разрезов зависит от особенностей микроскопического строения, характера поражения органа. Из почки, лимфоузла вырезают оба слоя, из печени, селезенки, легких - захватывают капсулу.

2.3. Отобранный материал тотчас помещают в фиксирующую жидкость. Для этого используют:

- Водный раствор продажного формалина (формалина 10-20 мл, воды водопроводной 90-80 мл). Разводить формалин дистиллированной водой не рекомендуется;

- Этиловый спирт. Используется как абсолютный, так и 96°;

- Ацетон. Применяется при необходимости быстрого фиксирования ткани.

Для выявления тонких цитологических структур употребляются сложные фиксирующие жидкости:

- Жидкость Карнуа (спирт абсолютный 60 мл, хлороформ 30 мл, уксусная кислота ледяная 10 мл). Жидкость готовится перед применением;

- Жидкость Буэна (насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 70 мл, формалин продажный 25 мл, уксусная кислота ледяная 5 мл). Жидкость готовится перед применением;

- Жидкость Мюллера (двухромовокислый калий 2,5 г, сернокислый натрий 1,0 г, дистиллированная вода 100 мл);

- Жидкость Орта (жидкость Мюллера 90 мл, формалин продажный 10 мл);

- Жидкость Ценкера (жидкость Мюллера 100 мл сулема 5,0 г, уксусная кислота ледяная 5 мл). Уксусная кислота добавляется перед применением;

Патологический материал фиксируют в стеклянной, эмалированной, керамической или полиэтиленовой посуде. Объем фиксирующей жидкости должен быть в 10 или более раз превышать объем патматериала. Через сутки фиксирующую жидкость меняют. В ветеринарной лаборатории патматериал помещают в свежую фиксирующую жидкость.

Помещенный в фиксирующую жидкость патматериал отправляют в ветеринарную лабораторию. В холодное время года во избежание промерзания патматериал, профиксированный в формалине, перекладывают в 30-50%-ный раствор глицерина, приготовленный на 10%-ном растворе формалина, или в 70° спирт, или в насыщенный раствор поваренной соли. При пересылке по почте профиксированный патматериал упаковывают в полиэтиленовый пакет. Кусочки перекладывают марлей или ватой, пропитанные раствором формалина или смесями, исключающими промерзание. Пакет с материалом помещают в другой или третий пакеты, затем упаковывают в бандероль или посылку.

Патматериал, отправляемый на исследование, маркируют. В емкость с кусочками помещают этикетку из плотной бумаги с указанием животного и даты отбора проб. Надписи делают простым карандашом. Если в емкости материал от нескольких животных, то каждый из них помещается в марлевый мешочек (или узелок), вместе с материалом помещается своя этикетка.

Патологический материал, предназначенный для гистологического исследования, следует уплотнить, иначе нельзя изготовить тонкие (10-20 мкм) срезы. Уплотнение гемогенизирует (делает однородным) материал, скрепляет тканевые элементы.

Наиболее употребительными способами уплотнения материала являются парафин, целлоидин, лед, желатина. Применяются также гликоль полиэтилен (карбовакс), эфирный воск, метакрилат, полиэтилен гликоль в смеси с нитроцеллюлозой и др.

2.4. Заливка в парафин.

Парафин представляет собой плотную массу, состоящую из смеси высокомолекулярных предельных углеводородов. Получают парафин как путем очистки озокерита (земляной воск), так и перегонкой из разных сортов нефти - бурых углей, торфа, сланцев. Парафин не обладает запахом, вкусом, растворяется в хлороформе, ксилоле, бензоле, сероуглероде, эфире. В патолого-гистологической технике пользуются аморфными сортами парафина. Перед употреблением парафин гемогенизируют, т.е. придают парафину аморфность и пластичность посредством повторного, сильного нагревания (на водяной бане, в кипящей воде) и быстрого охлаждения в снегу или холодной воде. Для большей пластичности к продажному парафину добавляют до 5% пчелиного воска.

Порядок заливки в парафин:

1.	Спирт 50°	1-2 суток
2.	Спирт 75°	1-2 суток
3.	Спирт 96°	1-2 суток
4.	Спирт абсолютный	1-2 суток
5.	Спирт-ксилол	2-3 часа
6.	Ксилол	2-3 часа
7.	Ксилол-парафин	2-3 часа
8.	Парафин I	4-6 часов
9.	Парафин II	4-6 часов

На 1 кусочек требуется 8-10 мл растворов.

Парафиновые блоки наклеивают на деревянные кубики, которые хранят в сухом месте.

2.5. Заливка в целлоидин.

Целлоидин представляет собой чистый сорт коллодионной нитроклетчатки.

Продаётся в виде пластин или стружки. До недавнего времени в качестве целлоидина использовали кино-, рентгенопленку, легко воспламеняющуюся, т.е. имеющую нитроцеллулоидную основу.

Заливка в целлоидин является наиболее распространенным и удобным способом уплотнения, т.к. обеспечивается более быстрая проводка и приготовление срезов.

Порядок заливки в целлоидин:

1.	Спирт 50°	1-2 суток
2.	Спирт 75°	1-2 суток
3.	Спирт 96°	1-2 суток
4.	Спирт абсолютный	1-2 суток
5.	Спирт-эфир	1 сутки
6.	Целлоидин I	3-4 суток
7.	Целлоидин II	2-3 суток

На 1 кусочек требуется 8-10 мл растворов.

Целлоидиновые блоки наклеивают на деревянные кубики, которые хранят в 70° спирте.

Лед в качестве уплотняющего средства применяют при изготовлении срезов на замораживающем микротоме.

Для гистологического исследования следует использовать только спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67.

2.6. Приготовление спиртов различной концентрации

Для получения спирта	Нужно взять миллилитров
	96° спирт		90° спирт		80° спирт		70° спирт
40°	42	58	44	56	50	50	57	43
45°	47	53	50	50	56	44	64	36
50°	52	48	56	44	63	37	71	29
60°	63	37	67	33	75	25	86	14
70°	73	27	78	22	88	12	-	-
80°	83	17	89	11	-	-	-	-
90°	94	6	-	-	-	-	-	-

Правило смешивания ("правило креста").

Требуемую концентрацию раствора спирта пишут в месте пересечения двух линий, а исходную концентрацию - у концов этих линий слева (большая - вверху, меньшая - внизу). Затем на каждой линии производят вычитание одного стоящего на ней числа из другого и разность пишут у свободного конца той же линии. Полученные числа (расположены справа вверху и внизу) указывают сколько весовых частей каждого раствора следует взять, чтобы получить раствор требуемой концентрации.

Пример: Для получения 40%-ного раствора спирта из 95%-ного следует взять 40 мл (весовых частей) 95%-ного спирта и 55 мл (весовых частей) воды.

      95    40

        \  /

         40

        /  \

       0    55

Заместитель руководителя Департамента ветеринарии

В.В. Селиверстов