Приложение В. Выявление иммунных IgG антител после разрушения IgM антител унитиолом

ПРИЛОЖЕНИЕ В

Выявление иммунных IgG антител после разрушения IgM антител унитиолом

Назначение метода:

I. Определение IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВО проводится при иммуногематологическом обследовании доноров, беременных, новорожденных с признаками гемолитической болезни, а также при исследовании причин гемотрансфузионных осложнений гемолитического типа;

2. Определение специфичности IgG антител к антигенам эритроцитов, выявленных при скрининге антител при наличии у пациента неспецифических IgM антител (бактериальных, лекарственных, прививочных и т.д).

Характеристика метода

Для инактивации IgM используют 5% раствор унитиола (2,3-димеркаптопропансульфонат Na), разрушающий дисульфидные связи в молекулах иммуноглобулинов. Выявление IgG антител проводят после разрушения IgM антител. Метод пригоден для дифференциальной диагностики IgG и IgM антител к антигенам эритроцитов любой специфичности в сыворотке крови человека, молоке, а также моноклональных антителах.

Меры предосторожности

При проведении исследования необходимо надевать одноразовые резиновые перчатки или пластиковые перчатки, т.к. образцы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

Выявление IgG анти-А, анти-В антител

Выявление IgG антител к антигенам эритроцитов системы АВО затруднено из-за одновременного присутствия в сыворотке естественных изогемагглютининов. относящихся к классу IgM. В данном методе иммунные IgG анти-А, анти-В антитела выявляются после полного разрушения унитиолом естественных IgM антител системы антигенов эритроцитов АВО. Выявление IgG анти-А, анти-В затем проводится методом прямой агглютинации с эритроцитами А и В.

Оборудование и реактивы

- 5% раствор унитиола (готовая лекарственная форма);

- моноклональные антитела анти-D IgM;

- тест-эритроциты групп крови А, В, а также эритроциты О резус-положительной принадлежности;

- реактив анти-IgG; или карты для агглютинации в геле, содержащие анти-IgG; и карты с нейтральным гелем для постановки контроля.

- раствор натрия хлорида 0,9%;

- термостат лабораторный на +37°С;

- планшеты с белой смачиваемой поверхностью;

- пробирки вместимостью 5-10 мл:

- пипетки;

- штативы;

- палочки аппликаторы;

- часы (секундомер);

- перчатки резиновые хирургические.

Порядок проведения исследования

1. В сухой чистой пробирке смешать равные объемы испытуемой сыворотки и 5% раствора унитиола - опыт.

2. Во второй пробирке смешать равные объемы моноклональных антител анти-D IgM и 5% раствора унитиола - контроль.

3. Все пробы инкубировать 24 часа при комнатной температуре (не ниже 16°С) или в термостате при +37°С.

4. Сыворотки, после обработки раствором унитиола, исследуют с эритроцитами А и/или В в непрямом антиглобулиновом тесте в общепринятой постановке и реактивом анти-IgG, или агглютинацией в геле с использованием карт, содержащих анти-IgG реактив.

5. Контроль исследуют с эритроцитами группы крови О резус-положительной принадлежности на плоскости без подогрева (время наблюдения - 5 мин) или методом агглютинации в геле с использованием карт с нейтральным гелем.

Интерпретация результатов

Сыворотки, инкубированные с раствором унитиола и сохранившие способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В, содержат анти-А или анти-В антитела класса IgG - положительный результат. Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии в исследуемом образце IgG антител к антигенам эритроцитов, при этом сыворотки, утрачивают способность агглютинировать эритроциты групп А и/или В.

В контрольной пробе результат должен быть всегда отрицательным, что свидетельствует о разрушении антител класса IgM в моноклональных антителах анти-D и эффективности действия унитиола.

Для установления титра IgG антител производят последовательное разведение сывороток, обработанных унитиолом. За титр принимают величину наибольшего разведению, в котором отчетливо видна агглютинация со стандартными эритроцитами А и/или В.

Выявление IgG антител к антигенам эритроцитов после разрушения антител IgM

Определение специфичности и наличия IgG антител к антигенам эритроцитов затрудняется одновременным присутствием в сыворотке неспецифических или аутоантител, относящихся к классу IgM. В данном методе специфические IgG антитела (имеющие клиническое значение) выявляются после полного разрушения IgM антител унитиолом.

Оборудование и реактивы

- 5% раствор унитиола (готовая лекарственная форма);

- моноклональные антитела анти-D IgM;

- тест-эритроциты для скрининга антител, а также эритроциты О резус-положительной принадлежности;

- раствор натрия хлорида 0,9%;

- лабораторный термостат на +37°С;

- планшеты с белой смачиваемой поверхностью;

- пробирки вместимостью 5-10 мл;

- пипетки;

- штативы;

- палочки аппликаторы;

- часы (секундомер);

- перчатки резиновые хирургические.

Порядок проведения исследования

1. В сухой чистой пробирке смешать равные объемы испытуемой сыворотки и 5% раствора унитиола - опыт.

2. Во второй пробирке смешать равные объемы моноклональных антител анти-D IgM и 5% раствора унитиола - контроль.

3. Все пробы инкубировать 24 часа при комнатной температуре (не ниже 16°С) или в термостате при +37°С.

4. Сыворотки, после обработки раствором унитиола, исследуют методом и с эритроцитами, которые использовали для скрининга антител. В контрольной пробе результат должен быть всегда отрицательным, что свидетельствует о разрушении антител класса IgM в моноклональных антителах анти-D и эффективности действия унитиола.

5. Специфичность антител подтверждают при идентификации с расширенной панелью тест-эритроцитов.

Условия хранения и эксплуатации

Срок хранения вскрытой ампулы 5% раствора унитиола (2,3-димеркаптопропансульфоната натрия) не должен превышать 5 дней при хранении в холодильнике (t° +2°-8°С).

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции по применению.

Примечание: для контроля полного разрушения IgM антител унитиолом используют только анти-D, содержащие IgM и не используют реактивы содержащие смесь анти-D IgM +IgG антител (которые иногда поставляют зарубежные производители).