Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой Brucella ovis, (инфекционный эпидидимит баранов) (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 13 ноября 1991 г.)

ГАРАНТ:

Согласно письму Департамента ветеринарии Минсельхоза России от 2 июля 2019 г. N 25-Ш-3679/ог-2793 настоящее Наставление действует в части, не противоречащей законодательству Российской Федерации и носит рекомендательный характер

1. Общие положения

1.1. Инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ) - хронически протекающая болезнь, поражающая как взрослых животных (бараны и овцематки), так и молодняк. Возбудитель - бруцеллы вида овис.

1.2. Диагноз на ИЭ ставят на основании результатов серологических, аллергических и бактериологических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков болезни.

Наиболее частое клиническое проявление болезни у половозрелых баранов - эпидидимиты и орхиты, у овцематок иногда наблюдаются аборты, у молодняка болезнь протекает в бессимптомной форме.

1.3. Диагностика ИЭ включает лабораторные (бактериологическое и серологическое) исследования материала, а также аллергические и клинические исследования животных в хозяйствах.

2. Взятие материала от животных и пересылка его для лабораторных исследований

2.1. При отборе проб крови и биологического материала необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.

2.2. Материал для лабораторных исследований отбирают от каждого животного в отдельности.

2.3. На бактериологическое исследование на ИЭ в лабораторию направляют: от баранов с клиническими признаками болезни - семенники с придатками, от овцематок - выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта, измененные участки плодовых оболочек, абортированные плоды, а от убитых животных - лимфатические узлы, кусочки селезенки, печени, почек, а от баранов дополнительно семенники с придатками и предстательные железы.

2.4. Отобранные для бактериологического исследования пробы упаковывают в целлофан или пергаментную бумагу, помещают в непроницаемую тару (ящик, банка, полиэтиленовый пакет), опечатывают и в тот же день направляют в лабораторию нарочным вместе с сопроводительным документом, в котором указывают наименование и адрес отправителя, опись проб биологического материала, краткую эпизоотическую характеристику хозяйства. От абортировавших овцематок одновременно с биологическим материалом направляют кровь для серологического исследования на ИЭ.

Если в течение 24-30 часов взятый материал доставить в лабораторию не представляется возможным, его консервируют стерильным 30%-ным водным раствором глицерина. Материал заливают консервирующей жидкостью в количестве, превышающем его объем в 4-5 раз.

2.5. На серологическое исследование в лабораторию направляют кровь или сыворотку крови.

2.5.1. Кровь у животных берут из яремной вены в стерильные пробирки в количестве 5-10 мл. Пробирки нумеруют и составляют опись проб.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для свертывания крови и отстаивания сыворотки пробирки с кровью выдерживают 30-50 мин при температуре 20-30°С, сгусток крови от стенок отделяют стальной спицей, а затем пробирки выдерживают при 4-10°С. Через 20-24 часа отстоявшуюся сыворотку сливают в сухие стерильные пробирки (лучше в пробирки Флоринского), закрывают пробками и направляют на исследование в лабораторию в свежем или консервированном виде.

Сыворотку консервируют добавлением 0,05 мл (1 капля) 5%-ного раствора карболовой кислоты на каждый миллилитр сыворотки при постоянном перемешивании или сухой борной кислоты (2-4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов.

Неконсервированные сыворотки пригодны для исследования в течение 6 суток со дня взятия проб, консервированные - в течение 30 суток.

Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию на ИЭ не подлежат.

3. Бактериологическая диагностика

3.1. Бактериологическая диагностика включает микроскопическое исследование мазков из исходного материала, постановку реакции нейтрализации антител (РНАт) с экстрактами из исходного материала или выделение культур бруцелла овис на питательных средах с последующей их идентификацией.

3.2. Микроскопическое исследование

Микроскопическому исследованию подвергают мазки из спермы от баранов с клиническими признаками эпидидимита и орхита.

Фиксированные на пламени мазки окрашивают по Граму и одному из следующих специальных методов: по Стампу (модифицированный метод Циль-Нильсена), Козловскому или Шуляку-Шин (см. приложение N 1, п. 1). При микроскопии учитывают, что бруцеллы вида овис - мелкие, грамотрицательные, расположенные отдельно, попарно или кучно, неподвижные коккобактерии, окрашивающиеся по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин в красный цвет.

3.3. Бактериологическое исследование

3.3.1. Для культивирования бруцелл вида овис используют мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый бульон (МППГГБ), плотный или полужидкий печеночно-сывороточный или печеночно-аминопептидный агар, сывороточно-декстрозный агар (см. приложение N 1, п. 2).

3.3.2. Высев материала из семенников, придатков семенников, печени, селезенки, лимфатических узлов производят с помощью стерильной пастеровской пипетки с резиновой грушей. Место прокола органа предварительно прижигают раскаленным шпателем. Набранный в пастеровскую пипетку из каждого органа материал переносят над пламенем спиртовки (газовой горелки) в пробирку с бульоном, затем из нее набирают в эту же пипетку бульон с суспензией посевного материала и засевают на 2 пробирки с агаром.

Посев материала из придатков семенников и семенников производят из 2-3-х мест (например, головки, тела и хвоста придатка), имеющих патологические изменения в виде уплотнений, бугристости, флюктуирующих участков, секвестров с гноеподобным содержимым.

Кожу абортированного плода перед посевом материала протирают с поверхности по белой линии тампоном, смоченным 70%-ным спиртом. Стерильными ножницами вскрывают брюшную и грудную стенку плода, набирают стерильными пастеровскими пипетками содержимое грудной и брюшной полостей и высевают материал в 1 пробирку с бульоном и 2 пробирки с агаром, а содержимое желудка - в 2 пробирки с бульоном и не менее 5 пробирок с агаром. Высевы из печени, селезенки, легких и сердца плода производят как указано в первом абзаце данного пункта.

3.3.3. Посевы инкубируют в термостате при 37-38°С в атмосфере, содержащей 10-15% углекислого газа.

Для создания атмосферы с повышенным содержанием углекислого газа засеянные пробирки помещают в эксикатор с хорошо пригнанной шлифованной крышкой, микроанаэростат или .

Необходимую концентрацию углекислого газа в эксикаторе можно получить путем:

заполнения части объема углекислым газом из баллона или аппарата Киппа;

сжигания сухой ваты. При этом пробирки с посевами должны занимать не более половины объема эксикатора.

3.3.4. Посевы выдерживают в термостате при 37-38°С в течение 30 дней с периодическим просмотром через каждые 3-5 дней визуально, а при необходимости через лупу. При отсутствии роста часть поверхности агара орошают конденсационной жидкостью. Пробирки с агаром и бульоном, заросшие посторонней микрофлорой, отбраковывают.

При просмотре посевов обращают внимание на характер роста микробов. На поверхности агара вырастают типичные для бруцелл мелкие (2-3 мм в диаметре), блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имеющие в отраженном свете голубоватый оттенок, в падающем - сероватый. Первичный рост может быть также в виде тонкого налета на поверхности среды. С возрастом колонии мутнеют и приобретают более темную окраску, что связано с появлением пигмента.

На полужидком сывороточном или амидопептидном агаре рост чистой культуры бруцелл овис отмечается только в верхней части среды в виде помутнения без резко выраженной границы с величиной столбика от 0,4 до 1 см.

Рост бруцелл овис на бульоне характеризуется равномерным помутнением среды с выпадением в дальнейшем небольшого осадка на дне пробирки.

При обнаружении роста на жидких средах и отсутствии характерного роста на агаре, из каждой пробирки готовят мазки, которые окрашивают одним из специальных методов и делают пересев на 2 пробирки с плотной средой для выделения чистой культуры. Пересевы в пробирках культивируют так же, как и высевы из биологического материала.

Выделенные культуры идентифицируют по тинкториальным (окраска мазков по Граму и одним из специальных методов - по Стампу, Козловскому или Шуляку-Шин), морфологическим, культуральным свойствам, в реакции агглютинации на стекле с помощью набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл, в который входят: R-сыворотка агглютинирующая бруцеллезная, S-сыворотка агглютинирующая бруцеллезная, R-антиген бруцеллезный цветной и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы (см. приложение N 2, п. 6).

Для проведения пластинчатой реакции агглютинации на стекле необходимы следующие материалы и компоненты: пастеровские пипетки, пробирки (серологические или бактериологические), пипетки мерные объемом 1, 2, 5 или 10 , петля бактериологическая, стекла предметные, спиртовка, увеличительное стекло (х2,5-4,5), емкость с дезинфицирующим раствором, испытуемая культура, набор для серологической дифференциации бруцелл (выпускается биопредприятием), а также 0,5%-ный карболизированный физиологический раствор рН 6,8-7,2.

Для исследования берут двухсуточные агаровые культуры. R- и S-сыворотки бруцеллезные агглютинирующие разводят 0,5%-ным карболинизированным физиологическим раствором до рабочего разведения, указанного в этикетке на коробке. Разведенные сыворотки допускается использовать в течение месяца. R-антиген бруцеллезный цветной для РА и антиген бруцеллезный для роз бенгал пробы в пластинчатой РА применяют неразведенными. Предметные стекла для реакции подготавливают общепринятым способом. Физиологический раствор, пробирки и пипетки должны быть стерильными.

Техника постановки реакции. На предметное стекло раздельно наносят по одной капле R- и S-сывороток бруцеллезных агглютинирующих и физиологического раствора. Испытуемую культуру бактериологической петлей отдельно эмульгируют в каплях R- и S-сывороток и в капле физиологического раствора для определения самоагглютинации культуры. Параллельно в каждом опыте ставят контроли:

R-сыворотки в разведении, указанном в этикетке на коробке, с цветным и роз бенгал антигенами; S-сыворотки в разведении, указанном на этикетке, с цветным бруцеллезным антигеном и в неразведенном виде - с роз бенгал антигеном.

Учет и оценка реакции. Реакцию учитывают невооруженным глазом или с помощью увеличительного стекла в течение 2 минут по следующей схеме:

++++ (4 креста) - полное просветление жидкости с образованием четкого, выраженного агглютината - положительная реакция;

+++ (3 креста) - неполное просветление жидкости с выраженным агглютинатом - положительная реакция;

++ (2 креста) - слабое просветление жидкости с нечетко выраженным агглютинатом - положительная реакция;

+ (1 крест) - жидкость без просветления с едва заметным агглютинатом - сомнительная реакция;

- (минус) - просветление жидкости не наступало, смесь гомогенная - отрицательная реакция.

Следует иметь в виду, что реакция с R-бруцеллезной сывороткой проходит замедленно, агглютинат, как правило, мелкозернистый. Результаты реакции с испытуемой культурой считают достоверными, если в контролях R- и S-бруцеллезных сывороток с гомологичными антигенами агглютинация четко выражена не менее, чем на три креста, и с гетерологичными отсутствует.

Реакцию с испытуемой культурой считают положительной при наличии агглютинации на два креста и более. При отрицательной реакции ее проводят повторно с этой же культурой, взятой из трех-четырех мест.

Испытуемую культуру при наличии положительной реакции с R- или S-сывороткой в отдельности или с обеими сыворотками одновременно при отсутствии самоагглютинации в физиологическом растворе по показаниям реакции агглютинации признают бруцеллами. Культура возбудителя инфекционного эпидидимита баранов постоянно агглютинируется только R-бруцеллезной сывороткой.

Культуры, обладающие типичными для бруцелл морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами, а также дающие положительную реакцию агглютинации, относят к бруцеллам.

3.4. Выявление бруцелл овис в биологическом материале с помощью реакции нейтрализации антител

3.4.1. Реакцию нейтрализации антител (РНАт) применяют для индикации возбудителя инфекционного заболевания овец, вызываемого бруцелла овис (инфекционный эпидидимит баранов) из биологического материала животных.

3.4.2. Оборудование, необходимое для постановки РНАт:

плексигласовые пластины на 72 лунки U-образной формы вместимостью 2,0 мл;

групповой дозатор Флоринского с пипетками вместимостью 0,25 мл или пипетки мерные вместимостью 1-2 мл;

калиброванные пипетки-капельницы с объемом капли 0,05 мл.

3.4.3. Компоненты для РНАт:

экстракты биологического материала от животных. Для исследования пригоден свежий, замороженный или консервированный 30%-ным раствором глицерина биологический материал. От баранов берут семенники, придатки семенников, сперму, предстательную железу и тестикулярные лимфатические узлы, от овец - выделения из половых путей (в первые дни после аборта), измененные участки рогов матки, надвыменные и глубокие тазовые узлы, а также абортированные плоды

эритроцитарный диагностикум (эритроциты барана, сенсибилизированные антигеном Бр. овис);

позитивная овисная сыворотка, изготовленная на предприятии;

физиологический раствор рН 7,2, содержащий 1% нормальной сыворотки крови лошади, инактивированной при 62-63°С в течение 30 минут;

формалинизированный (1%) физиологический раствор рН 10,0.

3.4.4. Экстракты биологического материала готовят следующим образом.

Навеску органа или лимфатического узла (2,0-3,0 г) измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным песком с соблюдением правил работы с инфицированным материалом. К растертому таким образом материалу добавляют четыре части формалинизированного (1%) физиологического раствора рН 10,0.

Сперму баранов, выделения из половых путей от абортировавших овец, содержимое желудка абортированного плода перед экстрагированием разводят в соотношении 1:1 формалинизированным (1%) физиологическим раствором рН 10,0.

Подготовленный материал переносят в бактериологическую пробирку и экстрагируют прогреванием в кипящей водяной бане в течение 30 минут. Полученный экстракт освобождают от плотных частиц путем фильтрования через бумажный фильтр. Фильтрат консервируют формалином, который вносят из расчета 0,5% к массе фильтрата, и исследуют в РНАт.

Использованную посуду, инструменты, бумажные фильтры с осадком обезвреживают кипячением или автоклавируют.

Ампулы (флаконы) с эритроцитарным диагностикумом перед постановкой реакции тщательно встряхивают до получения однородной (гомогенной) взвеси эритроцитов коричневого цвета без хлопьев и комочков.

Для определения рабочего разведения позитивной овисной сыворотки крови в РНГА ее разводят в соотношении 1:25 физиологическим раствором (0,1 мл сыворотки и 2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в водяной бане при 62-63°С в течение 30 минут.

В один вертикальный ряд (12 лунок) плексигласовой пластины вносят по 0,5 мл 1%-ного раствора нормальной сыворотки крови лошади (разбавитель сывороток) и в первую лунку добавляют 0,5 мл инактивированной позитивной овисной сыворотки (в разведении 1:25). Перемешивают сыворотку с разбавителем и 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, из второй - 0,5 мл смеси переносят в третью и т.д. Из последней лунки 0,5 мл смеси удаляют. К полученным разведениям сыворотки (1:50, 1:100, 1:200 и т.д.) добавляют по 0,05 мл эритроцитарного диагностикума. Осторожно встряхивают пластины для смешивания сывороток с эритроцитами, выдерживают при температуре 18-25°С в течение трех часов и учитывают результаты. Таким образом определяют предельный титр сыворотки.

Предельное разведение позитивной овисной сыворотки, при котором происходит агглютинация эритроцитов с оценкой не менее, чем на четыре креста, принимают за одну сывороточную единицу (1 с.е.). Рабочее разведение сыворотки должно быть в два раза ниже (2 с.е.). Например, предельный титр позитивной сыворотки составляет 6400 (1 с.е.), следовательно рабочий титр ее будет равен 6400 : 2 = 3200 (2 с.е.). Для приготовления рабочего разведения нативную позитивную сыворотку предварительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1:100, инактивируют в водяной бане при 62-63°С в течение 30 минут и затем готовят разведение сыворотки, необходимое для проведения РНАт. В данном примере, чтобы получить разведение сыворотки 1:3200, к 1 мл исходного ее разведения (1:100) необходимо добавить 31 мл физиологического раствора.

3.4.5. Постановка РНАт

Реакцию ставят в объеме 0,55 мл в двух лунках по схеме.

Схема постановки РНАт

Компоненты (в мл)	Испытуемый экстракт		Контроли
	контроль на неспецифическую агглютинацию	диагностическая лунка	с биофабричным антигеном		на самоагглютинацию эритроцитарного диагностикума
			контроль на неспецифическую агглютинацию	диагностическая лунка
Испытуемый экстракт	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Физиологический раствор с 1% нормальной сыворотки лошади	0,25	-	0,25	-	0,5
Позитивная овисная сыворотка в рабочем разведении	-	0,25	-	0,25	-

Пластины осторожно встряхивают для смешивания компонентов и помещают в термостат при температуре 37°С на два часа, затем вносят во все лунки эритроцитарный диагностикум.

Эритроцитарный диагностикум

0,05

0,05

0,05

0,05

0,05

Пластины вновь осторожно встряхивают для смешивания компонентов, выдерживают при температуре 18-25°С три часа и учитывают результаты.

При постановке РНАт в отдельных лунках ставят контроль для подтверждения правильности приготовления рабочего разведения позитивной овисной сыворотки путем постановки РНГА в пяти последовательных разведениях, начиная с рабочего.

3.4.6. Учет результатов реакции проводят через три часа после постановки и оценивают ее в следующем порядке:

положительная - сенсибилизированные эритроциты оседают в диагностической лунке в виде "пуговки" или компактного колечка с ровными краями;

отрицательная - сенсибилизированные эритроциты в диагностической лунке ровным слоем покрывают всю поверхность дна лунки в виде "зонтика", края агглютината иногда загибаются вовнутрь.

Результаты РНАт считают достоверными при:

отсутствии агглютинации эритроцитов испытуемым экстрактом в контроле без позитивной овисной сыворотки;

наличии положительной реакции в контроле с биофабричным овисным антигеном;

отсутствии самоагглютинации эритроцитарного диагностикума в физиологическом растворе;

подтверждении правильности выбора рабочего разведения позитивной овисной сыворотки в РНГА с эритроцитарным диагностикумом.

3.4.7. Результаты исследований экстрактов из биологического материала по каждой экспертизе, номера серий, дату изготовления и сроки годности эритроцитарного антигена, позитивной овисной сыворотки записывают в журнал серологических исследований.

В заключении лаборатории о результатах исследования экстрактов из биологического материала указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, отрицательная).

3.4.8. При получении положительного результата в РНАт диагноз на инфекционный эпидидимит считают установленным.

4. Методы серологической диагностики инфекционного эпидидимита баранов

4.1. Серологическая диагностика ИЭ заключается в обнаружении специфических антител в сыворотке крови овец к антигенам из бруцелл вида овис с помощью реакции агглютинации в пробирках (РА), реакции длительного связывания комплемента на холоде (РДСК) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

4.2. Постановка и учет результатов реакции агглютинации

4.2.1. Оборудование, материалы и компоненты

Для проведения пробирочной реакции агглютинации необходимы:

оборудование - термостат с температурой нагрева 37-38°С;

материалы - штативы, пробирки (серологические или бактериологические), пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 , мерные цилиндры, аппарат Флоринского, емкости вместимостью 100, 250, 500 мл;

компоненты - антиген овисный цветной для РА, испытуемые сыворотки крови животных, 0,15 М фосфатно-буферный раствор рН 8,6-9,0 с содержанием 5% NaCI (см. приложение N 2, п. 1), R-бруцеллезная сыворотка, негативная сыворотка барана.

4.2.2. Подготовка компонентов к реакции

Перед постановкой РА испытуемые сыворотки и антиген разводят фосфатным буферным раствором. Испытуемые сыворотки разводят 1:12,5. Антиген разводят 1:20.

4.2.3. Срок использования разведенного антигена и сывороток

Разведенные антиген и сыворотки используют в течение 2-х суток. Более длительное хранение не допускается.

4.2.4. Техника постановки реакции агглютинации

Реакцию агглютинации проводят в объеме 1 мл в разведении 1:25. Делают разведение испытуемой сыворотки 1:12,5, для чего в пробирки вносят по 0,04 мл сыворотки и добавляют по 0,5 мл фосфатного буферного раствора. В пробирки с исп мыми# сыворотками добавляют по 0,5 мл антигена, тщательно перемешивают. Одновременно к реакции ставят контроли с R-бруцеллезной, негативной сыворотками, фосфатно-буферным раствором и антигеном. Штативы с пробирками помещают в термостат при температуре 37-38°С на 16-18 часов затем выдерживают при комнатной температуре 5-6 часов и проводят учет реакции. Допускается проводить учет результатов реакции на следующие сутки.

4.2.5. Контроли реакции

К 0,5 мл R-бруцеллезной сыворотки в разведении 1:12,5 добавляют 0,5 мл антигена в разведении 1:20. Результат - полное просветление жидкости при наличии хорошо выраженного зонтика на дне пробирки (++++).

К 0,5 мл негативной сыворотки барана добавляют антиген в разведении 1:20. Результат - просветление жидкости отсутствует, на дне пробирки осадок в виде пуговицы или небольшого колечка.

К 0,5 мл антигена в разведении 1:20 добавляют 0,5 мл фосфатного буферного раствора. Результат - просветление жидкости отсутствует. На дне пробирки осадок в виде пуговицы или небольшого колечка, который при встряхивании легко разбивается образуя равномерную взвесь.

4.2.6. Учет результатов реакции

Результаты реакции агглютинации учитывают визуально и оценивают по четырехбалльной системе в крестах:

++++	(4 креста)	-	полное просветление жидкости при наличии хорошо выраженного "зонтика" на дне пробирки. При легком встряхивании "зонтик" разбивается. Положительная реакция;
+++	(3 креста)	-	"зонтик" на дне пробирки хорошо выражен, но жидкость слегка опалесцирует. Положительная реакция;
++	(2 креста)	-	жидкость слабо просветлена, на дне пробирки "зонтик". Сомнительная реакция;
+	(1 крест)	-	отсутствие или весьма незначительное просветление жидкости, "зонтик" на дне пробирки слабо выражен. Отрицательная реакция;
-	(минус)	-	осадок на дне пробирки в виде "пуговицы" или колечка, при встряхивании легко разбивается, образуя равномерную взвесь. Просветление жидкости отсутствует. Отрицательная реакция.

4.2.7. Диагностическая оценка реакции агглютинации

Реакцию считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови в разведении 1:25 с оценкой не менее чем на 3 креста. Реакцию считают сомнительной при наличии агглютинации в разведении 1:25 с сыворотками крови с оценкой не менее чем на 2 креста. При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного исследуют повторно через 25-30 дней. При сохранении у животного сомнительной РА таких животных признают больными.

4.3. Постановка и учет реакции длительного связывания комплемента на холоде

Реакцию длительного связывания комплемента на холоде (РДСК) проводят в пробирках в объеме сыворотки, антигена и комплемента по 0,2 мл, гемолитической системы в оттитрованной рабочей дозе.

4.3.1. Компоненты реакции и подготовка их к работе:

набор специфических компонентов для диагностики болезни овец, вызываемой бруцелла овис, включающий: антиген овисный для РДСК, позитивную овисную сыворотку, негативные сыворотки двух разных серий;

испытуемые и контрольные (позитивную и негативные) сыворотки инактивируют в водяной бане в день постановки реакции при температуре 63-64°С в течение 30 мин;

антиген овисный для РДСК применяют в рабочем титре, указанном предприятием, его изготовившем (см. приложение N 2, п. 6);

комплемент - сыворотка крови морской свинки (свежая, консервированная добавлением 4% борной кислоты или изготовленная на биопредприятии в лиофильно высушенном состоянии). При использовании в качестве комплемента свежей или консервированной сыворотки и при получении каждой новой серии сухого комплемента проводят титрование его в гемолитической системе для определения активности (см. приложение N 2, п. 4) и определяют рабочее разведение для РДСК (табл. 1).

Сухой биофабричный комплемент растворяют в физиологическом растворе, как указано на этикетке. Берут такое количество ампул (флаконов), в которых содержится необходимое для проведения всего опыта количество комплемента. Содержимое ампул (флаконов) сливают в одну пробирку (флакон), осторожно смешивают и хранят в холодильнике при плюс 2-6°С до использования;

гемолитическая сыворотка (гемолизин) берут в утроенном титре. Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца и при использовании каждой новой серии (см. приложение N 2, п. 5);

эритроциты барана - 3%-ная от осадка взвесь эритроцитов в физиологическом растворе (см. приложение N 2, п. 3).

Для приготовления гемолитической системы 3%-ную взвесь эритроцитов и гемолитическую сыворотку в рабочем разведении смешивают в равных объемах и выдерживают в холодильнике при плюс 2-6°С в течение 16-18 часов. При смешивании гемолизин вливают во взвесь эритроцитов;

физиологический раствор - 0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде рН 7,3-7,4 или физиологический раствор, содержащий ионы магния и кальция (см. приложение N 2. п. 2).

Таблица 1

Схема определения рабочего разведения комплемента для РДСК

Компоненты	Номера пробирок и разведения комплемента
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
	1:10	1:20	1:30	1:40	1:50	1:60	1:70	1:80	1:90	1:100
Приготовление разведений комплемента
Комплемент в разведении 1:10	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Физиологический раствор	-	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9
Титрование комплемента
Комплемент в разведениях	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Гемолитическая система	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 37-38°С - 10 минут
Примерный результат	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	НГ

В данном примере полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:50, рабочее разведение его в 2 раза меньше, т.е. 1:25.

Перед постановкой реакции компоненты проверяют на антикомплементарность и гемотоксичность по следующей схеме:

Компоненты	Проверка на
	антикомплементарность	гемотоксичность
		комплемента	гемолизина	антигена	физиологического раствора
комплемент в разведении 1:20	0,2	0,2	-	-	-
гемолизин в рабочем титре	0,2	-	0,2	-	-
антиген в рабочем титре	0,4	-	-	0,4	-
эритроциты (2,5% или 3%)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
физиологический раствор	-	0,6	0,6	0,4	0,8
водяная баня 10 минут при 37-38°С

Результат:

гемолиз

полная задержка гемолиза

В реакциях используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

4.3.2. Последовательность постановки РДСК

Первый день.	Розлив испытуемых и контрольных сывороток для главного опыта и для титрования гемолитической системы. Инактивирование сывороток. Контроль компонентов реакции на антикомплементарность и гемотоксичность. Розлив антигена и комплемента. Приготовление гемолитической системы. Помещение пробирок в холодильник.
Второй день.	Выдерживание пробирок главного опыта и гемолитической системы при комнатной температуре 20 минут. Титрование гемолитической системы. Определение рабочей дозы гемолитической системы. Главный опыт. Розлив гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками. Учет и оценка результатов реакции.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль на антикомплементарность сыворотки), при массовом исследовании реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном (см. табл. 3). Одновременно разливают сыворотки для титрования гемолитической системы. Для этого позитивную овисную сыворотку, негативные сыворотки (2 серии), взятые из набора, и одну сыворотку, взятую из исследуемой партии, разводят 1:5 физиологическим раствором (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора). Инактивирование сывороток крови проводят как указано выше в данном подпункте.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1:20, 1:25 или 1:30 в зависимости от его титра. Если титр комплемента в гемсистеме не известен, перед постановкой реакции определяют его рабочее разведение согласно схеме по таблице 1.

Розлив компонентов и последовательность постановки реакции осуществляют по схеме, указанной в таблице 3.

Перед розливом гемолитической системы в пробирки с исследуемыми сыворотками проводят титрование гемолитической системы по схеме согласно таблице 2.

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативными и испытуемой сыворотками и в безантигенном ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр на один интервал ниже (например: при титре гемолитической системы 0,6 мл, рабочий титр - 0,5 мл).

Примечание. Если в пробирках с испытуемой сывороткой и антигеном гемолиз будет отсутствовать, это означает, что для титрования гемсистемы была взята положительная сыворотка. В таких случаях при определении титра гемсистемы следует учитывать показания реакции в пробирках без антигена.

Таблица 2

Система титрования гемолитической системы

Компоненты реакции	Ряд пробирок в штативе	Номера пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Позитивная, негативные или испытуемая сыворотки в разведении 1:5	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	первый	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в рабочем титре	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Комплемент в рабочем разведении	первый	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	второй	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Холодильник 16-18 часов при плюс 2-6°
Гемолитическая система	первый	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
	второй	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	0,9	1,0
Водяная баня 37-38° - 20 минут
Примерный результат	первый	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ
	второй	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ

Таблица 3

Схема постановки РДСК

Компоненты реакции	При массовом исследовании		Для повторного исследования
	пробирки с испытуемыми сыворотками	контроль гемолитической системы	пробирки для каждой испытуемой сыворотки			контроль гемолитической системы
			1	2	3
Испытуемая сыворотка	0,04	-	0,04	0,04	0,02	-
Физиологический раствор	0,16	0,6	0,36	0,16	0,18	0,6
Водяная баня 63-64° - 30 минут
Антиген овисный в рабочем титре	0,2	-	-	0,2	0,2	-
Комплемент в рабочем разведении	0,2	-	0,2	0,2	0,2	-
Холодильник плюс 2-6° - 16-18 часов и 20 минут при комнатной температуре
Гемолитическая система в рабочем титре	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Водяная баня 37-38° - 20 минут

Контроли реакции:

негативные и позитивная овисная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена;

гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.

4.3.3. Учет результатов РДСК

Реакцию длительного связывания комплемента учитывают визуально. При постановке реакции в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках - через 3-4 часа, когда в контрольных пробах с позитивной овисной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками главного опыта оставляют в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в крестах по следующей схеме:

++++	(4 креста)	-	отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;
+++	(3 креста)	-	гемолиз 25% эритроцитов;
++	(2 креста)	-	гемолиз 50% эритроцитов;
+	(1 крест)	-	гемолиз 75% эритроцитов;
-	(минус)	-	полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень задержки гемолиза определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну. Из этой жидкости готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей схеме:

Номера пробирок	1	2	3	4	5
Гемолизированная жидкость	1,0	0,75	0,5	0,25	-
Физиологический раствор	-	0,25	0,5	0,75	1,0
Процент гемолиза	100	75	50	25	0

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в пробирках шкалы и процент гемолиза выражают в крестах.

4.3.4. Диагностическая оценка РДСК

При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном), все сыворотки, давшие задержку гемолиза в один крест и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза на 2-4 креста в одном или в двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена); сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15-30 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная РДСК, считают реагирующими положительно.

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток по каждой экспертизе, номера серий, сроки годности антигена, комплемента, гемолизина и их рабочие титры записывают в журнал серологических исследований.

В заключении лаборатории о результатах исследования сывороток крови животных указывают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и показания реакции в крестах.

4.4. Постановка и учет резу