Приложение N 2. Бактериологическая диагностика методом приготовления фосфатно-буферного раствора для РА

Приложение N 2
к Наставлению по диагностике
инфекционного эпидидимита баранов

1. Приготовление фосфатно-буферного раствора для РА

Для приготовления 0,15 M фосфатно-буферного раствора берут 23,8 г безводного двузамещенного фосфорнокислого натрия , растворяют в 1 литре дистиллированной воды, устанавливают рН 8,6-9,0 с применением 10% раствора натрия гидроокиси или соляной кислоты, затем добавляют 5% хлористого натрия (50 г на 1 л раствора).

2. Приготовление физиологического раствора хлорида натрия для РДСК

2.1. Для приготовления физиологического раствора хлорида натрия в 1 л горячей (60-70°С) дистиллированной воды растворяют 8,5 г хлорида натрия. Раствор охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят рН до 7,3-7,4 прибавлением раствора едкого натрия или соляной кислоты.

2.2. Для приготовления физиологического раствора хлорида натрия с добавлением ионов магния и кальция вначале готовят основные растворы солей магния и кальция путем растворения в отдельных флаконах (колбах) 1 г хлорида магния хч в 11,8 мл и 1 г хлорида кальция хч - в 54,4 мл дистиллированной воды. Основные растворы этих солей хранят в холодильнике.

Перед постановкой реакции берут на 1 л физиологического раствора хлорида натрия, приготовленного по п. 2.1., по 1,2 мл основных растворов хлорида магния и хлорида кальция. Смесь кипятят, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр и доводят рН до 7,3-7,4 прибавлением едкого натрия или соляной кислоты.

3. Получение и подготовка к работе эритроцитов барана для постановки РДСК

Кровь у барана берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд со стеклянными или фарфоровыми бусами (для дефибринирования) или в сосуд с налитым в него раствором Алсивера в количестве, равном объему крови (для дефибринирования и консервирования). Для консервирования дефибринированной крови применяют раствор стрептомицина (1 г стрептомицина, растворенного в 20 мл физиологического раствора, на 100 мл крови).

Дефибринированная кровь пригодна для исследования в течение трех дней, консервированная стрептомицином или раствором Алсивера - в течение 12 дней.

Приготовление раствора Алсивера: в 1000 мл дистиллированной воды растворяют 18,7 г глюкозы, 4,2 г хлорида натрия, 8,0 г лимоннокислого натрия, 0,5 г лимонной кислоты. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве (при 103-105°С в течение 30 минут) или через фильтр Зейтца.

Для приготовления суспензии эритроцитов крови барана берут свежую дефибринированную или консервированную кровь, центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 15 мин, жидкую часть сливают, а осадок 2-3 раза отмывают в физиологическом растворе путем центрифугирования в указанном порядке до полного обесцвечивания надосадочной жидкости.

4. Титрование комплемента в гемолитической системе

Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 с интервалами в дозах по 0,02 мл. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме, как указано в таблице 1.

Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее количество его, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин в водяной бане при 37-38°С.

В примере, приведенном в таблице 1, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

5. Титрование гемолизина

Гемолизин титруют периодически один раз в три месяца и каждую новую серию в разведениях 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500, 1:3000, 1:3500 и 1:4000 по схеме, как указано в таблице 2.

Разведения гемолизина готовят из основного (1:100) по следующей схеме:

Таблица 1

Схема титрования комплемента в гемолитической системе

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комплемент в разведении 1:20	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Физиологический раствор	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Гемолизин в удвоенном титре	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
2,5%-ная взвесь эритроцитов барана	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 10 минут при 37-38°
Примерный результат	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Таблица 2

Схема титрования гемолизина

Компоненты	Разведения гемолизина
	1:500	1:1000	1:1500	1:2000	1:2500	1:3000	1:3500	1:4000
Гемолизин	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:20	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Эритроциты (2,5%-ная взвесь)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 10 минут при 37-38°
Примерный результат	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ

Основное разведение гемолизина 1:100 (мл)	Физиологический раствор (мл)	Получаемые разведения
0,4	1,6	1:500
0,1	0,9	1:1000
0,1	1,4	1:1500
0,1	1,9	1:2000
0,1	2,4	1:2500
0,1	2,9	1:3000
0,1	3,4	1:3500
0,1	3,9	1:4000

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. В приведенной таблице 2 титр гемолизина равен 1:1500.

Рабочий титр гемолизина для РДСК в 3 раза выше. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий титр в РДСК будет 1:500.

6. Овисные антигены и наборы диагностикумов, используемые в серологических реакциях

Набор компонентов для серологической дифференциации культур бруцелл

Компоненты, входящие в набор, выпускают в соответствии с ТУ: сыворотки в ампулах в объеме по 2 мл, антигены во флаконах в объеме по 20 мл.

В набор входят:

R-сыворотка агглютинирующая бруцеллезная	-	4 ампулы;
S-сыворотка агглютинирующая бруцеллезная	-	4 ампулы;
R-антиген бруцеллезный цветной	-	1 флакон;