Приложение 10. Методические указания по изучению раздражающих и сенсибилизирующих свойств резин медицинского назначения, предназначенных для контакта с неповрежденной кожей человека, и установлению санитарных стандартов аллергенов, мигрирующих из них

ПРИЛОЖЕНИЕ 10

Методические указания по изучению раздражающих и сенсибилизирующих свойств резин медицинского назначения, предназначенных для контакта с неповрежденной кожей человека, и установлению санитарных стандартов аллергенов, мигрирующих из них
(утв. Министерством здравоохранения СССР 17 сентября 1985 г.)

Общие положения

В связи с возможностью развития заболеваний кожи в результате контакта с резиновыми изделиями, используемыми в медицине (хирургические и анатомические перчатки, напальчники, эластичные бинты, моче- и калоприемники, дренажные трубки, предметы санитарии и гигиены), возникла необходимость предварительной оценки их раздражающих и сенсибилизирующих свойств.

Биологическая активность резин обусловлена мигрирующим из них комплексом химических соединений, зависящий от состава рецептуры и технологического режима синтеза. Многие исходные продукты изготовления резин (хлоропреновый, стирольный, этиленпропиленовый, натрий-бутадиеновый, полисульфидный, фтористый каучуки, тиурам Д, неозон Д, парафенилендиаминовые антиоксиданты, ренацит и др.) обладают раздражающим и сенсибилизирующим действием. Однако, аллергенное действие резины определяется не только свойствами исходных ингредиентов. На резину распространяются закономерности комбинированного действия химических соединений. Кроме того, вновь образующиеся в резине продукты взаимодействия ингредиентов (в основном, каучуков и ускорителей вулканизации) могут придавать резине раздражающее и сенсибилизирущие свойства. Указанная особенность резин послужила основанием для разработки настоящих рекомендаций к постановке исследований резин, предназначенных для непосредственного контакта с кожей человека.

Разработка новых резин и резиновых изделий указанного назначения должна проводиться с учетом установленных гигиенических нормативов для мигрирующих веществ.

Методические указания предназначены для врачей-токсикологов НИИ гигиенического профиля и ведомственных токсикологических лабораторий, занимающихся исследованием резиновых изделий для медицины.

Методические указания включают следующие разделы:

- Порядок представления образцов на исследование.

- Анализ рецептуры резиновой смеси.

- Санитарно-химические исследования.

- Исследование раздражающего действия резиновых изделий в эксперименте на животных.

- Исследование раздражающего действия резин на людях-добровольцах.

- Изучение сенсибилизирующего действия резин.

- Гигиеническое регламентирование аллергенов, мигрирующих из резин.

1. Порядок представления образцов на исследование

При направлении на исследование необходимо представить следующие материалы:

- название (марка) материала или изделия и область его применения с указанием характера и длительности контакта с организмом;

- рецептуру композиции с указанием нормативной документации на ингредиенты, их названий и количество;

- краткое описание технологии изготовления изделий с указанием веществ, применяемых в процессе синтеза (катализаторов, инициаторов и т.д.) с результатами определения их остаточных количеств в композиции, а также температурных режимов процессов;

- наименование учреждения-изготовителя;

- предполагаемая продолжительность хранения изделия от момента изготовления до использования, режим хранения;

- вид стерилизации, из числа предусмотренных ОСТом 72-2-2-77.

Представляемые на испытание образцы должны пройти предстерилизационную очистку и (или) стерилизацию.

Для проведения исследований изделий, выпускаемых на импортных ингредиентах или по технологии зарубежных фирм, следует представлять документы, разрешающие применение данного изделия (или материалы) в стране-изготовителе.

Количество образцов, необходимое для проведения гигиенических исследований

Наименование изделий	Количество образцов
	штук
Бинты Мартинса	-	0,5
Жгуты Эсмарха	-	0,5
Подкладная клеенка	-	0,5
Кало- и мочеприемники	5	-
Подкладные круги	1	-
Напальчники	20	-
Перчатки	10	-

2. Анализ рецептуры резиновой смеси

Предварительным и обязательным этапом исследования является ознакомление с рецептурой и технологическим режимом синтеза изучаемого полимера с целью выявления в нем раздражающих веществ и аллергенов. Эти сведения помогают сделать некоторые рекомендации уже в процессе предварительного отбора. Например, не рекомендуется вводить в состав резиновой смеси с невысоким содержанием наполнителя одновременно несколько ингредиентов, обладающих выраженным аллергенным и раздражающим действием на кожу (тиурам Д, каптакс, неозон Д, ионокс, 4010 NA, натуральный каучук "смокедшит"). Из резин подобного типа (малонаполненных) происходит одновременная миграция нескольких продуктов, что создает опасность усиления биологического эффекта, характерного для комбинированного действия аллергентов.

3. Санитарно-химические исследования

Об опасности развития повышенной чувствительности к резине можно судить уже по миграции из нее химических соединений, обладающих аллергенными свойствами. Условия проведения санитарно-химических анализов определяются назначением резиновых изделий и режимом их эксплуатации. При контакте резины с кожей поступление химических соединений в организм происходит путем перехода их в жидкие продукты жизнедеятельности кожных желез. Исходя из этого, для проведения исследований резин из них рекомендуется приготовить экстракты на дистиллированной воде и физиологическом растворе. Учитывая односторонний контакт изделия с кожными покровами, при экстрагировании берется соотношение поверхности образца резины к объему экстрагента, равное 1:2 .

Приготовление вытяжек проводится в термостате при температуре 37-40°С в течение 24 часов. Указанные условия экстрагирования резин предусматривают некоторую аггравацию с целью осуществления наиболее полного перехода токсичных веществ из резины в контактирующие среды.

Образцы изделий перед испытаниями обрабатывают теплой водой с мылом с последующим ополаскиванием дистиллированной водой или подвергают специальной стерилизации, предусмотренной инструкцией по эксплуатации изделия. Результаты испытаний выражаются в количестве мигрирующего вещества (мг) со 100 поверхности резины.

Набор санитарно-химических показателей зависит от состава резиновой смеси и включает в себя 3 основные группы исследуемых показателей:

1. Исследование вытяжек интегральными методами (определение содержания окисляемых и непредельных соединений, рН среды);

2. Качественное и количественное определение индивидуальных веществ, мигрирующих из резин в модельные среды (компоненты резиновых смесей и продукты их превращения).

3. Идентификация остаточных мономеров каучука, а также продуктов, применяемых при синтезе и технологическом процессе переработки резины.

Проведенные детальные химические анализы могут выявить непригодность резин для применения по назначению. Критериями выбраковки служат содержание в модельных средах токсичных веществ в количествах, превышающих установленные санитарные нормативы ДКМ, а также одновременная миграция из резин несколько аллергеноопасных соединений на уровнях, близких к порогу раздражающего и сенсибилизирующего действия.

4. Исследование раздражающего действия резиновых изделий в эксперименте на животных

4.1. Способ исследования

Наиболее приемлемой моделью для изучения раздражающего действия резиновых изделий остаются морские свинки-альбиносы или свинки пестрой масти с белыми пятнами на боках.

Нанесение резины на кожу экспериментальных животных осуществляется с помощью фиксирующей бинтовой повязки. Животным прикрепляются кусочки резины площадью 6,5 , смоченные физиологическим раствором, на выстриженный участок боковой поверхности туловища.

4.2. Сроки исследования

Общее количество аппликаций зависит от назначения изделий. Изделия, предназначенные для кратковременного одноразового использования, испытываются в течение 5 дней (аггравация на индивидуальную и видовую чувствительность).

Изделия, имеющие длительный повторный контакт с кожей человека перчатки, напальчники, подкладные круги и т.д.), должны исследоваться в течение 20 рабочих дней. Это вызвано тем, что по нашим многолетним наблюдениям резиновые изделия проявляют раздражающее действие после 10-15-дневного контакта с кожей. Кроме того, указанные сроки позволяют проводить оценку функционального состояния кожи в динамике. Продолжительность ежедневного воздействия 6 часов.

4.3. Методы исследования

Объективными показателями раздражающего действия являются количественная оценка эритемы и отека кожи. Оценка эритемы в баллах проводится по колориметрической линейке С.В. Суворова и соавторов (1977). Для измерения отека кожи применяется обычно микрометр. Нами предлагается более удобный способ измерения отека с помощью толщиномера TP-1-10. Толщиномер имеет плоские измерительные поверхности и шкалу часового типа, что создает определенные преимущества его перед микрометром. Проводить измерения может один человек. При работе с прибором следует левой рукой собрать кожу животного в складку и поместить между измерительными поверхностями прибора, который находится в правой руке. Показания читаются на шкале прибора. Рекомендуется проводить на каждом участке кожи по 3 измерения и вычислять среднюю величину. В процессе работы необходимо следить, чтобы внешний край измерительной поверхности прибора совпадал с краем кожной складки.

Наиболее значимыми с гигиенической точки зрения функциональными изменениями кожи, приводящими к развитию дерматитов, являются нарушения ее барьерной функции (pH, нейтрализующей способности, алкилрезистентности). В связи с этим в качестве обязательных показателей рекомендуется проводить измерение рН, устойчивости к щелочам или нейтрализующей способности кожи. Перечисленные методы подробно описаны в литературе (Иевлева Е.А., и соавт., 1977; Колпакова А.И., 1967 и др.). Приводим предложенную нами модификацию методики Burkchardta, изучения нейтрализующей способности кожи. Сущность метода заключается в способности кожи нейтрализовать вещества, обладающие щелочной реакцией. Методика основана на регистрации времени, за которое универсальная индикаторная бумага, пропитанная щелочным раствором, восстановит первоначальный цвет. На участок кожи, слегка увлажненный дистиллированной водой, накладывается отрезок универсальной рН - индикаторной бумаги длиной 1 см, смоченной 0,002Н раствором едкого натра (рН 8,0). По секундомеру отмечается время, за которое зеленый цвет бумаги восстанавливается до первоначального желтого (рН 6,0). В качестве контроля используется участок туловища животного, симметричный опытному. Обследование животных проводится каждые 6 дней.

Для математической обработки результатов исследований применяется общепринятый в токсикологии критерий Стьюдента-Фишера.

Критериями раздражающего действия резиновых изделий служат наличие воспалительной реакции кожи у 50% животных от 0,1 балла и выше (суммарно - по эритеме и отеку), усиление реакции кожи при продолжении воздействия, стойкость функциональных изменений кожи при отсутствии видимой реакции.

5. Исследование раздражающего действия резин на людях-добровольцах

В случае отрицательных результатов испытаний резиновых изделий на животных проводят исследования по оценке первичного раздражающего действия на людях-добровольцах. Для этого подбирают группы волонтеров (не менее 15 человек), включая лиц обоего пола и любого возраста (кроме детей), не имеющих кожных заболеваний в анамнезе.

Образцы резины поверхностью 2x2 см в количестве 3-х штук наносят на внутреннюю поверхность предплечья на расстоянии 3 см друг от друга, закрепляя их медицинским лейкопластырем. Количество аппликаций (от 1 до 20) и продолжительностью ежедневной экспозиции (от 6 до 24 часов) колеблются в зависимости от назначения изделия. Реакцию (зуд, чувство жжения, краснота, шелушение, высыпания и пр.) оценивают по окончании ежедневной аппликации и до повторного нанесения образца на следующий день. Возникновение любых изменений на местах нанесения образца служит сигналом к прекращению испытаний.

Образец считается удовлетворительным, если незначительные изменения на коже могут быть отнесены к разряду случайных, то есть появляются на одном месте не более, чем у 2-х человек.

После наблюдений на людях-добровольцах проводятся более продолжительные клинические испытания (совместно с врачами-дерматологами) за лицами, пользующимися изделиями.

6. Исследование сенсибилизирующего действия резин

6.1. Способ исследования

Эксперимент проводится на морских свинках-альбиносах или с белыми пятнами на боках. Животным с помощью фиксирующей бинтовой повязки прикрепляют резиновые пластинки на правую сторону освобожденной от шерсти боковой поверхности туловища. Площадь резины составляет 6,5 . Перед нанесением резину смачивают дистиллированной водой или физиологическим раствором.

6.2. Сроки исследования

Проявление сенсибилизирующих свойств резиновых изделий наблюдается после длительного повторного контакта с организмом человека и связано с миграцией из них химических аллергенов. Относительно низкие уровни миграции химических соединений обусловливают, как правило, слабые сенсибилизирующие свойства резин. В связи с этим продолжительность периода сенсибилизации животных путем повторных накожных аппликаций резин должна составить не менее 20 дней.

6.3. Методы исследования

В качестве показателей аллергенного действия рекомендуется применять общепринятые в промышленной аллергологии тесты: кожные и конъюнктивные провокационные пробы, реакции выявления клеточных и гуморальных антител in vitro (РСАЛ, РСЛЛ, РСМП) и другие. Подробное описание методик дано в методических указаниях "Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны". Невозможность полной расшифровки химического состава мигрирующего из резин комплекса соединений делает необходимым постановку разрешающего тестирования не только с исходными аллергенами, введенными в резиновую смесь, но и с резиной в целом. Кожные провокационные пробы ставятся путем нанесения резины на участок тела, симметричный подопытному, на 6 часов. В качестве антигенов при конъюнктивальном тестировании и в реакциях in vitro применяются водные вытяжки из резин. Вытяжки готовят на дистиллированной воде или физиологическом растворе в термостате при температуре 37°С в течение суток. Подбор рабочей концентрации антигена осуществляется варьированием соотношения площади поверхности образца к объему экстрагента и обычно составляет от 5:1 до 8:1 .

Для выявления местных аллергических реакций достаточно чувствительным и информативным является метод количественного подсчета тучных клеток (тканевых базофилов) в коже лабораторных животных. Для морфологических исследований кожу фиксируют в 12% формалине, заливают в парафин. Окрашивают срезы гематоксиллинэозином и толуидиновым синим полихромным, окрашивающим тучные клетки в малиновый цвет. На срезах подсчитывают среднее количество тучных клеток в поле зрения микроскопа (увеличение 900), учитывая при этом количество зрелых, незрелых, дегранулированных и опустошенных клеток. Функциональное состояние клеток определяют по индексу созревания и индексу активности .

В качества контроля используют кожу интактных животных. Оптимальным сроком для взятия материала являются пятые сутки после начала аппликаций на кожу. Полученные результаты статистически обрабатываются с помощью критерия Стьюдента-Фишера.

Критериями сенсибилизирующего действия резины служат наличие единичных положительных реакций на антиген у подопытных животных.

7. Гигиеническое регламентирование аллергенов, мигрирующих из резин

7.1. Предварительная оценка опасности вещества по литературным данным

Практически все химические соединения, внедряемые в промышленность, проходят первичную токсикологическую оценку, включающую сведения о их резорбтивном, раздражающем и сенсибилизирующем действии. Вещества, биологический характер действия которых не изучен, могут быть проанализированы по следующему плану: физико-химические свойства (липофильность, растворимость в воде, коэффициент распределения октанол-вода и масло-вода), ориентировочная оценка резорбтивных свойств с использованием расчетных формул (3), принадлежность к известным классам аллергенов (2).

Химические соединения, относящиеся к чрезвычайно опасным по классификации Г.И. Румянцева и соавторов (3) и к сверх кумулятивным по классификации Л.М. Медведя, не должны допускаться к применению в резинах, предназначенных для повторного контакта с кожей человека.

Нормирование по общетоксическому признаку химических соединений, относящихся к классу малоопасных и не кумулирующих в организме, не имеет практического значения.

7.2. Количественная оценка резорбтивного действия

Исследованию подлежат вещества, обладающие высокой степенью липоидорастворимости, относящиеся к высоко- и умеренноопасным классам соединений, обладающие выраженными кумулятивными свойствами.

Порядок испытаний изложен в методических указаниях "Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно-допустимых уровней загрязнений кожи" (1).

Оценка резорбтивного действия включает установление среднесмертельных уровней , среднеэффективного времени гибели животных , порогов острого и хронического действия ( и ), зон острого и хронического действия ( и ), коэффициента кумуляции.

7.3. Оценка раздражающего действия

Исследованию подлежат вещества, способные вызывать раздражение кожи в концентрациях от 0,1% и ниже при однократном воздействия (1 класс).

7.3.1. Способ исследования

Вещество испытывается на 2 видах животных (как правило, морских свинках и кроликах) путем нанесения его в виде раствора или взвеси в дистиллированной воде на выстриженный участок боковой поверхности туловища.

7.3.2. Сроки исследования

Число повторных аппликаций не менее 20, что позволяет проследить за функциональным состоянием кожи в динамике, а также выявить накопление раздражающего эффекта.

7.3.3. Методы исследования

Для оценки раздражающего эффекта применяются количественные методы измерения интенсивности эритемы и отека кожи, изменения (функционального состояния кожи: pH, алкалирезистентности нейтрализующей способности.

Критериями для установления пороговой концентрации вещества служат наличие воспалительной реакции кожи у 50% животных от 0,1 балла и выше (суммарно по эритеме и отеку) при продолжении воздействия, стойкость функциональных изменений кожи при отсутствии видимой реакции.

7.4. Количественная оценка сенсибилизирующего действия

Исследованию подлежат вещества, относящиеся по химической структуре к известным классам аллергенов. Нормирование по аллергенному действию проводится для вещества, обладающего специфическим сенсибилизирующим эффектом, то есть когда порог общетоксического действия выше порога аллергенного действия . Поэтому начальная концентрация вещества должна быть ниже не менее, чем в 2 раза, а каждая последующая уменьшается в 10 раз. Дальнейший ход исследований совпадает с изложенным в этапе 5 первого раздела настоящих "Методических указаний". Величина определяется развитием сенсибилизации у отдельных животных, выявляемой положительными реакциями на антиген не менее, чем по двум тестам.

7.5. Установление допустимого количества миграции (ДКМ) химических веществ из резин

Гигиеническая стандартизация резин проводится в 2 этапа:

1. Установление ДКМ для изолированно взятых веществ (исходных или образующихся в резине).

2. Апробация норматива ДКМ на готовых резинах.

7.5.1. Установление ДКМ для химических соединений

Первый этап нормирования основан на результатах исследования биологической активности отдельно взятых химических соединений.

ДКМ для веществ, обладающих специфическим сенсибилизирующим действием, устанавливается, исхода из порога аллергенного действия (Lim al cut). Для нахождения Lim al необходимо определить содержание вещества, способного мигрировать из резин в вытяжку или модельную среду.

Расчет рабочей концентрации вещества, используемой в экспериментальных исследованиях, осуществляется по формуле:

,

где: К - рабочая концентрация вещества в %;

А - содержание вещества (г) в вытяжке (л);

S - поверхность резинового материала, используемого для приготовления 1 л модельных растворов (500 );

р - поверхность резины, используемая в эксперименте (6,5 )

100 - коэффициент для перевода концентрации из г/мл в %;

V - объем рабочего раствора для нанесения вещества на кожу (0,1 мл).

Если миграция ТМТД из резин колеблется в пределах 0,1-3,0 мг/л, в формулу вводят наибольшую величину (3,0 мг/л), т.е. используя вышеприведенную формулу, рабочая концентрация ТМТД составят 0,04%.

Наряду с расчетной в опыте используют дополнительно еще две концентрации: на порядок выше и ниже реально существующей (в нашем случае 0,4 и 0,004%).

Допустимое количество миграции (ДКМ) химических веществ (мг/л) рассчитывается по формуле:

где: S - поверхность резинового материала, используемого для приготовления модельных растворов (обычно 500 );

К - величина концентрации в %

Р - поверхность резины, используемой в эксперименте (6,5 );

- индекс запаса.

Величина коэффициента запаса колеблется от 3 до 5 в зависимости от выраженности сенсибилизирующих свойств вещества (в соответствии с методическими рекомендациями "Постановка исследования по гигиеническому нормированию промышленности аллергиков в воздухе рабочей зоны", ДКМ для химических веществ, облагающих специфическим раздражающим действием, устанавливается на уровне в 10 раз ниже порога раздражающего действия.

7.5.2. Гигиеническая регламентация резин (апробация ДКМ, установленного для химического соединения на готовых резинах)

Установленный для отдельно взятого химического вещества гигиенический норматив не всегда гарантирует безопасность резины. Вредное влияние резины на живой организм может быть неидентично с действием ингредиентов, из которых она изготовлена. Это обусловлено возможностью образования в процессе ее изготовления химических соединений, имеющих иную структуру и иные токсические свойства, чем вещества, вводимые в состав смеси. Имеет значение комбинированное действие веществ, придающее резине качественно новые биологические свойства. Наиболее активно взаимодействующими и образующими большинство продуктов превращения в резине являются каучуки, ускорители вулканизации и вулканизующие агенты. Кроме того, большинство ускорителей вулканизации относятся к классу аллергенов и гигиеническое нормирование их остаточных количеств в резине является первоочередной задачей.

Значительное число ингредиентов, доходящее до 20, колебания их процентного содержания в рецептуре затрудняют выявление причины биологической активности резин. Поэтому представляется целесообразным проверять установленные нормативы на модельных композициях. Модельная композиция должна отвечать следующим требованиям: содержать минимальное число компонентов, отвечать технологическим требованиям, предъявляемым к данному типу резин. Проводится сопоставление аллергенной активности модельной резины и изолированно взятого соединения, мигрирующего из резины и для которого ранее бала установлена величина ДКМ.

В случаях совпадения эффекта гигиеническая регламентация резин данного типа осуществляется по нормативу, для этого соединения. Тип резины различается по виду каучука, ускорителя вулканизации и вулканизующих агентов. Добавление в рецептуру резин ингредиентов, не обладающих сенсибилизирующими свойствами и не подвергающихся превращению в процессе изготовления, не влияет на аллергенные свойства резин. К таким ингредиентам относятся наполнители, пластификаторы, пигменты.

При усилении аллергических свойств модельной композиции за счет комбинированного действия нескольких аллергенов необходима корректировка гигиенического норматива путем увеличения коэффициента запаса (в 10 и более раз).

В случаях образования в резине нового аллергена (при распаде ускорителя вулканизации, вулканизующего агента или при взаимодействии ускорителя вулканизации с каучуком) необходимо установление ДКМ для выявленного аллергена.

По окончании испытаний составляется гигиеническое заключение о возможности применения изделия по назначению, куда включаются сведения о составе резиновой смеси, результаты санитарно-химических и токсикологических исследований.