Методические указания МУК 4.1.1432-03 "Определение остаточных количеств Римсульфурона в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Методические указания МУК 4.1.1432-03
"Определение остаточных количеств Римсульфурона в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 июня 2003 г.)

Дата введения: 30 июня 2003 г.

2. Методика определении остаточных количеств Римсульфурона в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Римсульфурона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта путем перераспределения между двумя несмешивающимися органическими растворителями и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак-Амин). Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Метрологическая характеристика метода

Метрологические параметры, р = 0,95, n = 20
анализируемый объект	предел обнаружения, мг/кг (мг/л)	диапазон определяемых концентраций мг/кг (мг/л)	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S	доверительный интервал среднего результата, %,
Картофель	0,01	0,01-0,1	74,45	1,7	2,11

Таблица 2

Полнота определения Римсульфурона в клубнях картофеля (5 повторностей для каждой концентрации)

Среда	Внесено Римсульфурона, мг/кг (мг/л)	Обнаружено, мг/кг (мг/л)	Доверительный интервал,	Полнота определения, %
Клубни картофеля	0,01	0,00743	0,0001	74,30
	0,02	0,01482	0,0004	74,10
	0,05	0,03650	0,0008	73,00
	0,10	0,07640	0,0008	76,40
среднее				74,45

2.1.3. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании картофеля.

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

Римсульфурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,8%, фирма Дюпон
Ацетонитрил	ТУ 6-09-3534-87
Вода бидистиллированная, деионизированная	ГОСТ 7602-72
Гексан, ч	ТУ 6-09-3375-78
Гелий, осч
Калий марганцовокислый, чда	ГОСТ 20490-75
Кислота ортофосфорная, хч	ГОСТ 6552-80
Кислота уксусная, ледяная	ГОСТ 61-75
Натрий сернокислый, безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий хлористый, хч	ГОСТ 4233-77
Натрия гидроокись, хч	ГОСТ 4328-77
Подвижная фаза для ВЭЖХ:
ацетонитрил - 400 мл, 0,1%-ный
водный раствор ортофосфорной кислоты - 600 мл
Концентрирующие патроны
Диапак-Амин (0,6 г), Диапак С	ТУ 4215-002-05451931-94
Фильтры бумажные, "красная лента"	ТУ-6-09-1678-86
Хлороформ, ч	ГОСТ 20015-74
Этиловый эфир уксусной кислоты	ГОСТ 223000-76
Фильтры для очистки растворителей, диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс.

2.2.2. Приборы и оборудование

Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами
Диапак-Амин
Ванна ультразвуковая
Весы аналитические ВЛА-200, или аналогичные	ГОСТ 34104-80 Е
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности г	ГОСТ 19491-74
Воронки делительные на 250 и 500 мл	ГОСТ 25336-82Е
Воронки конические, стеклянные диаметром 50-60 мм	ГОСТ 25336-82Е
Встряхиватель механический или аналогичный	ТУ 64-673М
Колбы конические плоскодонные на 250 и 500 мл	ГОСТ 9737-70
Колбы мерные на 25,50 и 100 мл	ГОСТ 1770-74
Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP 18, зернением 5 мкм
Концентраторы грушевидные и круглодонные, объемом 50, 100 и 250 мл, КТУ-100-14/19	ГОСТ 10394-75
Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50-100 мкл
Насос водоструйный	ГОСТ 10696-75
Пипетки мерные на 0,2; 1,0; 2,0; и 5,0 мл	ГОСТ 20292-74
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или аналогичный	ТУ 25-11-917-74
Стаканы стеклянные на 100-500 мл	ГОСТ 25366-80Е
Хроматограф жидкостный "Уотерс 510" с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа.

2.3. Подготовка к определению

2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Колонку Symmetry Shield RP 18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25°С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин в течение 3-4 ч.

2.3.2. Подготовка растворителей

Перед началом эксперимента проверяют чистоту гексана, этилацетата и хлороформа. Для этого досуха упаривают на ротационном вакуумном испарителе 100 мл растворителя, добавляют в концентратор 2 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют при 230 нм. При недостаточной чистоте растворителей проводят их очистку.

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором марганцовокислого калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика, Москва, 1976, с. 441).

Хлороформ встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика, Москва, 1976, с. 443).

Этиловый эфир уксусной кислоты промывают равным объемом 5%-ного раствора соды, сушат над безводным хлористым кальцием (Беккер Г. и др. Органикум. Москва, 1979, с. 372), кипятят в течение 1 ч с прокаленным сульфатом магния и затем перегоняют.

Бидистиллят кипятят в течение 6 ч с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

Магний сернокислый 7-водный прокаливают в течение 5 ч (до полного испарения воды).

2.3.3. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 100 мг Римсульфурона в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор с концентрацией Римсульфурона 1,0 мг/мл). Затем 10,0 мл стандартного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор с концентрацией Римсульфурона 100,0 мкг/мл). Стандартные растворы можно хранить в холодильнике в течение месяца. Для хроматографического исследования и внесения в контрольные образцы из стандартного раствора с концентрацией 100 мкг/мл методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл Римсульфурона.

2.3.4. Приготовление растворов для проведения анализа

2.3.4.1. Приготовление 0,05 М фосфатного щелочного буфера с pH 9.

В мерную колбу объемом 1 000 мл помещают 800 мл дистиллированной воды и растворяют в ней 8,75 г калия фосфорнокислого двузамещенного и 100 г хлористого натрия, доводят рН по потенциометру до 9,0, используя 1 М раствор гидроксида натрия, после чего доводят раствор до метки дистиллированной водой.

2.3.4.2. Приготовление 0,1%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате.

В мерную колбу объемом 100 мл помещают 50 мл этилацетата и туда же добавляют 0,1 мл ледяной уксусной кислоты и доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивая. Раствор используют для элюирования Римсульфурона с концентрирующего патрона Диапак С.

2.3.4.3. Приготовление 2%-ного раствора уксусной кислоты в этилацетате.

В мерную колбу объемом 100 мл помещают 50 мл этилацетата и туда же добавляют 2,0 мл ледяной уксусной кислоты и доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивая. Раствор используют для элюирования Римсульфурона с концентрирующего патрона Диапак-Амин.

2.3.5. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

2.3.5.1. Приготовление 0,1%-ного раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 1 000 мл наливают 500 мл очищенной воды, добавляют туда 1 мл концентрированной ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и тщательно перемешивают.

2.3.5.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.

В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 400 мл ацетонитрила и 600 мл 0,1 %-ного раствора ортофосфорной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин в течение 5 мин, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

2.3.6. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из стандартных растворов, содержащих Римсульфурон, с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Римсульфурона.

2.3.7. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-Амин (0,6 г) для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин.

Патрон Диапак-Амин устанавливают на влонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 мл этилацетата. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности концентрирующего патрона!

2.3.7.1. Проверка хроматографического поведения Римсульфурона на концентрирующем патроне Диапак-Амин.

Из стандартного раствора Римсульфурона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 2 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30°С. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на концентрирующий патрон. Затем в концентратор добавляют 5 мл этилацетата, обмывают стенки концентратора и полученный раствор также вносят на концентрирующий патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют. Концентратор тщательно обмывают 10 мл 0,1%-ной уксусной кислоты в этилацетате и смесь также вносят на концентрирующий патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют.

Римсульфурон элюируют с концентрирующего патрона 10 мл 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате порциями по 5 мл, элюат после внесения каждой порции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С. Остатки уксусной кислоты отдувают холодным воздухом. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Римсульфурон, и объединяют их.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы картофеля хранят в полиэтиленовой таре в морозильной камере при температуре -18°С.

2.5. Описание определения

2.5.1. Клубни картофеля

Экстракция и предварительная очистка. Образец измельченных клубней картофеля массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 50 мл ацетонитрила и экстрагируют на ультразвуковой ванне в течение 5 мин и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 мл ацетонитрила и экстрагируя на ультразвуковой ванне 5 мин и дополнительно 5 мин на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 500 мл через фильтр "красная лента". В ту же воронку добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в химический стакан объемом 250 мл, а верхний гексановый слой отбрасывают.

Затем ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 50 мл гексана. После полного разделения слоев нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор через ватный тампон, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт упаривают до водного остатка при температуре не выше 30°С.

К водному остатку в концентраторе добавляют 100 мл фосфатного буфера (0,05 М , рН 9), тщательно обмывают стенки концентратора и раствор переносят в чистую делительную воронку. К раствору в делительной воронке добавляют 50 мл хлороформа и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой (хлороформ) отбрасывают. Водный остаток в делительной воронке промывают еще раз 50 мл хлороформа, хлороформ отбрасывают, а водный остаток переносят в химический стакан емкостью 100 мл и подкисляют 0,1 М раствором фосфорной кислоты до рН 3,5 (по потенциометру).

Подкисленный водный раствор переносят в делительную воронку, добавляют туда же 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 100 мл, а гексан отбрасывают. Водный остаток возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 50 мл гексана. Собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Экстракцию повторяют еще двумя порциями ацетонитрила по 20 мл, экстракты объединяют и упаривают досуха при температуре не выше 30°С.

Очистка экстракта. Сухой остаток растворяют в 5 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на концентрирующий патрон. Затем в концентратор добавляют 5 мл этилацетата, обмывают стенки концентратора и полученный раствор также вносят на концентрирующий патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 мл 0,1%-ной уксусной кислоты в этилацетате и смесь также вносят на концентрирующий патрон. Элюат отбрасывают.

Римсульфурон элюируют с концентрирующего патрона 10 мл 2%-ной уксусной кислоты в этилацетате, элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила, помещают на 5 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывая стенки колбы, и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1. Условия хроматографирования

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP 18, 4,6 мм х 25 см, чернением 5 мкм.

Предколонка Symmetry Shield RP 18, 4,6 мм х 2 см, зернением 5 мкм.

Время выхода Римсульфурона 9,24-9,81 мин.

Альтернативная колонка Symmetry Shield RP 18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Время выхода Римсульфурона 12,91-13,73 мин.

Температура колонки: 25°С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% ортофосфорная кислота в соотношении 40:60.

Чувствительность 0,005 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2-20 нг.

2.6.2. Обработка результатов анализа

Содержание Римсульфурона рассчитывают по формуле:

, где

X - содержание Римсульфурона в пробе, мг/кг или мг/л;

- высота (площадь) пика стандарта, мм;

- высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемого образца, г (мл);

Р - содержание Римсульфурона в аналитическом стандарте, %.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. Разработчики

Калинин В.А., профессор, канд. с-х. наук, Довгилевич Е.В., канд. биол. наук, Калинина Т.С., канд. с-х. наук, Довгилевич А.В., канд. хим. наук, Устименко Н.В., канд. биол. наук.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976-43-26.

Главный государственный санитарный врач Российской Федерации, Первый заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации

Г.Г. Онищенко