Приложение N 1

Приложение N 1

1. Методы окраски бруцелл

Окраска мазков по Стампу. Фиксированный на пламени мазок окрашивают в течение 10 мин. раствором карболового фуксина Циля в разведении 1:10, слегка промывают водой и дифференцируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в течение 30 с. Вновь тщательно промывают водой и докрашивают 1%-ным раствором метиленового синего в течение 20 - 30 с. Краску сливают, мазок промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - красные, другая микрофлора и фон препарата - синие.

Окраска мазков по Козловскому. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 2%-ным раствором сафранина, подогревая до появления пузырьков. Затем мазок быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 0,75 - 1%-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 0,5 - 1 мин. Краску сливают, мазок промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - ярко-красные, другая микрофлора и фон препарата окрашены в зеленый цвет.

Раствор малахитового зеленого может быть заменен 1%-ным раствором метиленового синего или бриллиантовой зелени.

Окраска мазков по Шуляку-Шин. Фиксированный на пламени мазок окрашивают в течение 2 мин. карболовым фуксином Циля, разведенным 1:5, промывают водой и докрашивают в течение 5 мин. 2%-ным водным раствором метиленового синего. Краску сливают, мазок промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: бруцеллы - ярко-красные, другая микрофлора и фон препарата окрашены в сине-голубой цвет.

2. Приготовление питательных сред

Мясная вода. Свежее мясо крупного рогатого скота освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают одним литром водопроводной воды и выдерживают в течение 15 - 18 ч в прохладном месте. Затем настой кипятят в течение 30 - 40 мин., доливают дистиллированную воду до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр или полотно. Полученную мясную воду стерилизуют при 120°С в течение 20 мин.

Печеночная вода. Свежую печень крупного рогатого скота освобождают от жира, канальцев, пленок и пропускают через мясорубку. 500 г фарша заливают 1 л водопроводной воды, настаивают в течение 1 ч и кипятят при помешивании в течение 30 мин. После отстаивания фарш удаляют, в полученную жидкость доливают дистиллированную воду до первоначального объема и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по колбам, стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 30 мин.

Мясо-пептонный печеночно-глюкозо-глицериновый агар (МППГГА).

К 610 мл мясной воды добавляют 305 мл печеночной воды, 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 20 - 30 г агар-агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь варят в течение 1 ч в автоклаве, фильтруют через нейлоновый или ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2 - 7,4, добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Среду разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 30 мин. рН среды до стерилизации 7,2 - 7,4 после стерилизации 6,8 - 7,0.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) готовят аналогично МППГГА, но без добавления агар-агара, глюкозы и глицерина.

Печеночный глюкозо-глицериновый агар (ПГГА). К печеночной воде добавляют 1% пептона, 0,5% х.ч. хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара, предварительно промытого и хорошо отжатого. Смесь варят в течение 1 ч в автоклаве, фильтруют через нейлоновый или ватный фильтр, устанавливают рН 7,2 - 7,4, добавляют 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 30 мин. После стерилизации рН среды 6,8 - 7,0.

Печеночный глюкозо-глицериновый бульон готовят аналогично ПГГА, но без добавления агар-агара.

Картофельный агар. 500 г очищенного картофеля (берут белые или желтые клубни средней величины), нарезанного ломтиками, варят в одном литре водопроводной воды до готовности (избегать сильного разваривания картофеля). Затем отвар фильтруют через ватный фильтр и дистиллированной водой доводят объем до первоначального (1 л). К фильтрату добавляют 1% пептона, 0,5% х.ч. хлорида натрия и 2 - 3% агар-агара. Смесь варят до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2 - 7,4 и отстаивают в теплом месте. В застывшем агаре срезают нижний слой с осадком, а прозрачную часть агара расплавляют и фильтруют через ватный фильтр. Вновь устанавливают рН 7,2 - 7,4, добавляют 1% глюкозы и 3% глицерина, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 30 мин. После стерилизации рН среды - 6,8 - 7,0.

Сывороточно-декстрозный агар. К 835 мл дистиллированной воды добавляют 20 г агар-агара, 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия и 165 мл мясной воды. Смешивают, кипятят до расплавления агара, устанавливают рН 7,8. Затем стерилизуют текучим паром в течение 1 ч, после чего пар закрывают, давление доводят до 2 атм. и нагреватель выключают. После автоклавирования среду отстаивают в течение 1 ч, затем фильтруют через ватный или бумажный фильтр, доводят рН до 7,2 - 7,4, разливают в колбы (пробирки, флаконы) и стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 30 мин. После стерилизации рН среды 6,8 - 7,0.

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 50 - 60°С и добавляют к ней нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади и раствор декстрозы, профильтрованные через стерилизующие пластины фильтра Зейтца. Конечная концентрация сыворотки в среде должна быть 10%, декстрозы 1%.

Печеночно-сывороточный и печеночно-аминопептидный агар.

К 1000 мл печеночной воды добавляют 10 г пептона, 5 г х.ч. хлорида натрия, 20 г агар-агара. К полученной смеси добавляют 17 мл 10%-ного раствора двууглекислой соды, автоклавируют при 115°С (0,7 атм.) в течение 20 - 25 мин. и фильтруют через ватный фильтр. Устанавливают рН 7,2 - 7,4 и добавляют 10 г глюкозы и 20 мл глицерина. Разливают в колбы и стерилизуют при 115°С (0,7 атм.) в течение 20 мин. После стерилизации рН среды 6,8 - 7,0. Перед применением среду расплавляют, охлаждают до 50 - 60°С и добавляют 10 - 20% стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота (овец) или 10 - 15% аминопептида, затем разливают в пробирки или бактериологические чашки.

Эритрит агар. Представляет собой готовую питательную среду для выделения бруцелл. Готовится по прописи предприятия-изготовителя.

3. Определение концентрации углекислого газа

В пробирку наливают 2 - 3 мл 0,1%-ного раствора бикарбоната натрия и добавляют 1 - 2 капли 0,5%-ного раствора бромтимолового синего. В обычной атмосфере смесь имеет отчетливый синий цвет.

Пробирку ставят в эксикатор, в котором необходимо определить содержание углекислого газа. Учет проводят через 1 ч по изменению окраски смеси, пользуясь следующей таблицей:

Окраска смеси	Процентное содержание в атмосфере эксикатора
Синяя	до 5
Сине-зеленая	5
Зеленая	10
Зелено-желтая	15
Желтая	20