Приложение 3. Диагностика дирофиляриоза

Приложение 3

Диагностика дирофиляриоза

Диагностика дирофиляриоза основана на клинических признаках, данных эпидемиологического анамнеза и результатах лабораторных исследований.

1. Клинические признаки

Дирофиляриозы (дирофиляриатозы) (шифр по МКБ-10 - В74.8) - группа трансмиссивных зоонозных биогельминтозов, проявляющихся у человека, как правило, образованием подвижной опухоли под кожей на различных участках тела, включая подкожную клетчатку, параорбитальную область, верхнее и нижнее веки глаза, мошонку, грудные железы, реже под конъюктивой глаза, внутри глазного яблока, в плевре, легком, печени, брызжейке, сальнике, стенке кишечника, маточной трубе, слизистой полости рта.

Клинически инвазия D. repens человека проявляется появлением мигрирующего образования. Иногда возникает отек в местах локализации филярий в коже и подкожной клетчатке и во многом напоминает отек Квинке. При надавливании на место отека ямки не остается, ощущается зуд и жжение. Локализация отеков непостоянна. Возникнув на одном участке кожи, через 2-3 дня он исчезает и через несколько дней или недель вновь появляется на другом участке. Перемещение отеков определяется миграцией филярий. В ряде случаев дирофиляриоз проявляется в виде плотного неподвижного образования по типу фибромы размером с фасолевое зерно или появлением под кожей нитеобразного гельминта, извилистые движения которого хорошо заметны и являются патогномоничным симптомом этого заболевания (рис. 3.1). Некоторые больные предъявляют жалобы на ощущение "ползания" под кожей или внутри образования.

При поражении конъюнктивы часто развивается конъюнктивит. При проникновении взрослой дирофилярии в переднюю камеру глаза паразит виден по характерным движениям. Наличие дирофилярии в глазном яблоке часто протекает бессимптомно, больной жалуется на "видение в глазу гельминта".

Почти у 60% больных паразит локализуется в области головы и шеи, у 25% - в области конечностей, у 11% - туловища и у 4% - наружных половых органах. Активная миграция паразита в подкожную клетчатку наблюдается у 35% больных дирофиляриозом. При обследовании пациентов в периферической крови в 33% случаев определялась эозинофилия от 6 до 22%.

По данным эпиданамнеза, длительность инкубационного периода дирофиляриоза у людей составляет от 6 до 8 месяцев. Заболеваемость носит сезонный характер с двумя пиками - весенний (март-апрель) и осенний (сентябрь-октябрь). Риск заражения человека приурочен к периоду максимальной активности комаров, например, на юге России это конец весны и начало осени, когда погодные условия сезона передачи наиболее благоприятны как для переносчика, так и для развития инвазионной личинки в нем.

В дооперационной диагностике дирофиляриоза в случаях внутриорганной локализации паразитов клиническое значение имеют рентгенологические, ультразвуковые и другие инструментальные методы обследования.

2. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика дирофиляриоза проводится в медицинских организациях, испытательных лабораторных центрах и специализированных научно-исследовательских институтах, имеющих лицензию на работу с возбудителями паразитарных болезней.

В лабораторию доставляются следующие биологические материалы для исследований:

- взрослые особи дирофилярий или их фрагменты, выделенные хирургическим путем или самопроизвольно вышедшие из пораженных тканей;

- гистологические препараты внутренних органов и тканей;

- кровь, пунктаты подкожных образований;

- удаленные подкожные образования (инфильтраты, гранулемы, кисты).

2.1. Макроскопическое исследование

При макроскопическом исследовании визуально идентифицируют взрослых гельминтов, поместив их на большую стеклянную пластину, которую предварительно смачивают водой или 50%-м раствором глицерина. На этой пластине проводят измерение длины гельминтов.

Взрослые гельминты - дирофилярии - имеют нитевидное тело, покрытое тонко исчерченной кутикулой. Самки от самцов отличаются размерами (самки в 2,5-3 раза длиннее самцов).

2.2. Микроскопические исследования

Морфологические исследования

Наличие кутикулярной орнаментации в виде продольных гребней на поверхности тела гельминтов - основной диагностический признак нематод рода Dirofilaria. При микроскопии (увеличение 400) на теле дирофилярий просматривается также нежная поперечная исчерченность кольцевидной формы, благодаря которой дирофилярий активно продвигаются под кожей (D. repens).

Морфологические признаки распространенных на территории Российской Федерации взрослых дирофилярий, паразитирующих у плотоядных животных, - D. repens, D. immitis, D. ursi - приведены в прилож. 1.

Дифференциальными признаками видового отличия являются:

- длина и ширина тела самцов и самок;

- наличие на поверхности кутикулы продольной и кольцевидной исчерченности у D. repens и D. ursi;

- поверхность кутикулы D. immitis - гладкая, но под ней просматривается продольная рельефность, наличие латеральных крыльев на хвостовом конце;

- строение пищевода (наличие железистого и мышечного отделов);

- соотношение и расположение относительно переднего конца тела внутренних органов (нервное кольцо, половые трубки, вульва), экскреторного и анального отверстий;

- морфология и число половых сосочков у самцов;

- структура, размеры и расположение спикул у самцов.

Гистологические исследования

При микроскопическом исследовании гистологических препаратов часто обнаруживается очаг хронического воспаления, в центре которого находится свернутая в клубок нематода - круглый червь, многократно срезанный в поперечном или косом направлении. Дифференциальным признаком при морфологическом определении дирофилярий является наличие кутикулярных "шипов", соответствующих вершинам продольных кутикулярных гребней (рис. 3.2). Для дирофилярии D. repens они являются одним из диагностических признаков. В гистологических срезах хорошо просматриваются внутренние органы, в том числе и половые трубки гельминта.

В гистологических препаратах может наблюдаться картина острого аллергического воспаления при условии относительно свежего заражения и сохранения жизнедеятельности гельминта. При длительном развитии патологического процесса нематода находится в зоне некроза. В инфильтрате преобладают эозинофилы (до 70% клеточного состава), лимфо-гистиоцитарные клетки и макрофаги.

2.3. Исследование крови на наличие микрофилярий

Метод концентрации микрофилярий в осадке по Кнотту

1. В центрифужную пробирку собирают 1 мл крови из вены, гемолизируют в 9 мл 1%-го раствора уксусной кислоты.

2. Пробирки центрифугируют при 2 000 об./мин в течение 3 мин.

3. Полученный осадок (0,5-1,0 мл) переносят на обезжиренные предметные стекла и микроскопируют в нативном виде.

4. Препараты с обнаруженными личинками высушивают, фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимза.

Идентификация вида личинок проводится под иммерсией (увеличение 900, 1 000).

Примечание. Методика исследования может быть упрощена за счет того, что для гемолиза эритроцитов используют дистиллированную воду в соотношении 1:10.

В осадке концентрируются живые подвижные микрофилярии.

Метод мембранной фильтрации микрофилярий по Беллу, модифицированный Супрягой и Андреенковым

1. В центрифужную пробирку собирают 1 мл крови, гемолизируют в 9 мл 1-3%-го раствора уксусной кислоты или 2%-го раствора формалина.

2. Фильтруют гемолизированную кровь и смывы 2-3 раза с пробирки на мембранные фильтры под вакуумом.

3. Полученный осадок на фильтре под вакуумом фиксируют 20-30 мл крутого кипятка, и фильтры вынимают из фильтродержателя.

4. Фильтры высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимза.

5. Контроль качества окраски личинок в препаратах проводится по степени окрашивания ядер лимфоцитов.

6. Окрашенные фильтры тщательно споласкивают водой и высушивают.

7. Микроскопирование фильтров проводят на предметном стекле, предварительно покрыв всю поверхность фильтра тонким слоем иммерсионного масла, при малом увеличении с применением препаратоводителя.

8. Идентификацию окрашенных микрофилярий проводят под иммерсией (90х, 100х), их количество учитывают отдельно по видам.

Примечание. Метод упрощается, если вместо специального аппарата использовать шприц с фильтродержателем, мембраной "Миллипор" диаметром 25 мм и размером пор 5 мкм, который поддерживается снизу мягкой прокладкой.

Микрофилярий на окрашенных фильтрах, пропитанных иммерсионным маслом, сохраняют морфологические признаки в течение 5 лет и более (рис. 3.3).

2.4. Молекулярно-биологические методы диагностики дирофиляриоза

Методом ПЦР можно исследовать самих паразитов, в том числе их фрагменты, кровь, нативный биопсийный материал от больных, а также переносчиков (комаров) с целью обнаружения ДНК дирофилярий (качественный анализ). Для ПЦР-идентификации дирофилярий разработано несколько пар видоспецифичных праймеров. К примеру, для идентификации Д. repens можно использовать праймеры DIR3 F-5' - CCGGTAGAC CATGGCATTAT-3' и DIR-4 R-5' - CGGTCTTGGACGTTTGGTTA-3'. Режимы амплификации: 94°С - 5 мин, 48 циклов (94°С - 30 с, 50°С - 30 с, 72°С - 1 мин) и 72°С - 5 мин. Праймеры амплифицируют фрагмент размером в 246 нуклеотидных пар.

Для идентификации D. immitis можно использовать праймеры: COI intF - 5'-TGATTGGTGGTTTTGGTAA-3' и COI intR 5'-ATAAGTACGAGTATCAATATC-3' с режимами 94°С - 30 с, 30 циклов (94°С - 1 мин, 50°С - 2 мин, 72°С - 3 мин) и 72°С - 5 мин. Праймеры амплифицируют фрагмент размером в 656 нуклеотидных пар (рис. 3.4).

При пробоподготовке - выделении ДНК из комаров-переносчиков - необходимо провести предварительное механическое измельчение биологического материала (при исследовании комаров в 1 пул входит 5-10 особей) в лизирующем растворе согласно инструкции, прилагающейся к набору для выделения ДНК.

2.5. Исследование комаров на наличие личинок дирофилярий

Подготовку комаров к лабораторному исследованию на зараженность дирофиляриями проводят согласно нормативным документам.

Перед вскрытием живых самок комаров обездвиживают эфиром или в морозильной камере (-18°С) в течение 10-15 минут. После этого погружают на несколько секунд в этиловый спирт, промокают на фильтровальной бумаге и помещают в каплю физиологического раствора на предметное стекло. Под стереоскопическим микроскопом (объектив 3-4х) препарируют комара, первоначально отсекая крылья и конечности, а затем разделяют на 3 части: голову с ротовым аппаратом, грудной отдел и брюшко. Из брюшка выделяют желудок и мальпигиевы сосуды. Для этого острием препаровальной иглы надрывают хитиновый покров между седьмым и восьмым члениками брюшка. Затем концом одной иглы фиксируют хитин первого членика брюшка комара, а другой иглой осторожно вытягивают содержимое брюшка за обнажившуюся часть кишечника в месте разрыва хитина. При этом освобождается желудок комара вместе с мальпигиевыми сосудами. Из хитиновой оболочки головы комара и грудного отдела извлекают содержимое, надавливая сверху иглой, расположенной горизонтально. При препарировании хоботка хорошо отделяется нижняя губа, в которой могут быть обнаружены личинки третьей стадии (L3). Подготовленный нативный препарат закрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом (объектив 10x, а для уточнения вида и стадии развития дирофилярий объектив 40x). Личинки первой стадии (L1) могут быть обнаружены в желудке, второй (L2) - в мальпигаевых сосудах и третьей (L3) - в гемолимфе комара и его хоботке. При этом хорошо видно движение дирофилярий.

Перед вскрытием мертвых комаров, собранных в течение сезона их активности, предварительно помещают в 96° этиловый спирт на 30-60 минут, затем вскрывают по вышеописанной методике. Препарату дают подсохнуть и без дополнительной фиксации окрашивают по Романовскому-Гимза. После этого препарат просматривают под микроскопом и регистрируют наличие или отсутствие личинок дирофилярий в комаре (рис. 3.5-3.8).

36