Глава II. Эквивалентные методы

Глава II
Эквивалентные методы

А. Метод переваривания объединенной пробы с использованием механических приспособлений/метод осаждения

1. Оборудование и реактивы

(a) Нож или ножницы для отбора проб.

(b) Поддоны, разделенные на 50 квадратов, в каждый из которых можно поместить образец мяса весом приблизительно 2 г, или другие инструменты, которые обеспечивают эквивалентные гарантии в отношении прослеживаемости образцов.

(c) Мясорубка или электрический измельчитель.

(d) Лабораторный измельчитель-гомогенизатор Stomacher 3500, термомодель.

(e) Пакеты полиэтиленовые для лабораторного измельчителя-гомогенизатора Stomacher.

(f) Конические сепарационные воронки объемом 2 литра, предпочтительно оснащенные предохранительными пробками с тефлоновым покрытием.

(g) Стойки, кольца и зажимы.

(h) Сетчатые фильтры с размером ячеек 180 микрон, внешним диаметром 11 см с ячейками из нержавеющей стали или из латуни ¹⁷.

(i) Воронки с внутренним диаметром не менее 12 см для поддержки сетчатых фильтров.

(j) Стеклянные мерные цилиндры вместимостью 100 мл.

(k) Термометр с точностью до 0,5°C в пределах от 1 до 100°C.

(l) Вибрирующее устройство, например, электробритва со снятой головкой.

(m) Реле, которое включается и отключается с интервалом в одну минуту.

(n) Трихинеллоскоп с горизонтальным столом или стереомикроскоп с платформой проходящего света регулируемой интенсивности.

(o) Лоток для подсчета личинок и несколько чашек Петри диаметром 9 см, как в пунктах (l) и (m) Главы I(1).

(p) 17,5% соляная кислота.

(q) Пепсин, концентрация: 1:10000 NF (Национальный формуляр США), соответствующая 1:12500 ВР (Британская фармакопея) и 2000 FIP (Международная федерация фармацевтов), или стабилизированный жидкий пепсин с концентрацией минимум 660 Европейских фармакопейных единиц на мл.

(r) Несколько 10-литровых емкостей для обеззараживания оборудования, например, формальдегидом, и для желудочного сока, оставшегося после тестирования положительных проб.

(s) Весы с точностью не менее 0,1 г.

2. Отбор проб и количество, подлежащее перевариванию

Согласно Главе I(2).

3. Процедура

I. Измельчение

Предварительное измельчение образцов мяса в мясорубке улучшит качество процесса переваривания. Если используют электрический измельчитель, то его необходимо приводить в действие три-четыре раза, каждый раз приблизительно в течение одной секунды.

II. Процесс переваривания

Данная процедура используется для полных объединенных образцов (пробы общей массой 100 г) или для объединенных образцов массой менее 100 г.

(a) Полные объединенные образцы (пробы общей массой 100 г):

(i) Лабораторный измельчитель-гомогенизатор Stomacher 3500 оснащают двойным полиэтиленовым пакетом и прибором для контроля температуры в диапазоне 40 - 41°С.

(ii) Полтора литра воды, предварительно нагретой до 40 - 41°С, выливают во внутренний полиэтиленовый пакет.

(iii) К воде в гомогенизаторе Stomacher добавляют 25 мл 17,5% соляной кислоты.

(iv) Добавляют 100 проб весом приблизительно по 1 г каждая (при температуре 25 - 30°С), отобранных от каждого отдельного образца в соответствии с пунктом 2.

(v) Последним добавляют 6 г пепсина или 18 мл жидкого пепсина. Необходимо строго соблюдать данный порядок, чтобы не допустить распада пепсина.

(vi) Затем при помощи гомогенизатора Stomacher размельчают содержимое пакета в течение 25 минут.

(vii) Полиэтиленовый пакет извлекают из гомогенизатора Stomacher, а пищеварительную жидкость фильтруют через сетчатый фильтр в 3-литровый лабораторный стакан.

(viii) Полиэтиленовый пакет промывают приблизительно 100 мл воды, которую затем используют для ополаскивания сетчатого фильтра, и в итоге добавляют к фильтрату в лабораторном стакане.

(ix) К объединенному образцу из 100 проб можно добавить не более 15 индивидуальных проб и исследовать их совместно с данными пробами.

(b) Меньшие объединенные образцы (менее 100 проб):

(i) Лабораторный измельчитель-гомогенизатор Stomacher 3500 оснащается двойным полиэтиленовым пакетом и прибором для контроля температуры в диапазоне 40 - 41°С.

(ii) Пищеварительную жидкость готовят путем смешивания полутора литров воды и 25 мл 17,5% соляной кислоты. Добавляют 6 г пепсина и все перемешивают при температуре 40 - 41°С. Необходимо строго соблюдать данный порядок, чтобы не допустить распада пепсина.

(iii) От пищеварительной жидкости отмеряют объем из расчета 15 мл на грамм пробы (например, для 30 проб требуется объем 30 х 15 мл = 450 мл), который переносят во внутренний полиэтиленовый пакет вместе с пробами мяса каждая весом приблизительно 1 г (при температуре 25 - 30°С), отобранными от каждой отдельной пробы в соответствии с пунктом 2.

(iv) Во внешний пакет наливают воду температурой приблизительно 41°С, чтобы общий объем в двух пакетах достиг полутора литров. Затем при помощи гомогенизатора Stomacher размельчают содержимое пакета в течение 25 минут.

(v) Полиэтиленовый пакет извлекают из гомогенизатора Stomacher, а пищеварительную жидкость фильтруют через сетчатый фильтр в 3-литровый лабораторный стакан.

(vi) Полиэтиленовый пакет промывают приблизительно 100 мл воды (при температуре 25 - 30°С), которую затем используют для ополаскивания сетчатого фильтра, и в итоге добавляют к фильтрату в лабораторном стакане.

III. Выделение личинок посредством осаждения

- К пищеварительной жидкости добавляют лед (300 - 400 г чешуйчатого или дробленого льда), чтобы довести общий объем до 2 литров. Затем пищеварительную жидкость размешивают до тех пор, пока лед не растает. В случае работы с меньшими объединенными образцами (см. Раздел II(b)) количество льда пропорционально уменьшают.

- Охлажденную пищеварительную жидкость переливают в двухлитровую сепарационную воронку, оборудованную вибрирующим устройством с дополнительным зажимом.

- Осаждение проводят в течение 30 минут на протяжении которых воронка подвергается интервальным вибрациям, т.е. одна минута вибрации чередуется с одной минутой простоя.

- По истечении 30 минут необходимо быстро перелить пробу осадка объемом 60 мл в мерный цилиндр вместимостью 100 мл (воронка после использования ополаскивается моющим раствором).

- 60 мл пробы необходимо оставить минимум на 10 минут, после чего надосадочную жидкость извлекают посредством отсасывания и оставляют 15 мл для исследования на присутствие личинок.

- Для отсасывания можно использовать одноразовый шприц с пластиковой трубкой. Длина трубки должна быть такой, чтобы в мерном цилиндре осталось 15 мл, а ободок шприца при этом находился на краях цилиндра.

- Оставшиеся 15 мл выливают в лоток для подсчета личинок или в две чашки Петри и проводят исследование с помощью трихинеллоскопа или стереомикроскопа.

- Мерный цилиндр ополаскивают 5 - 10 мл водопроводной воды, а смывы добавляют к пробе.

- Переваренные пробы проверяют сразу после их получения. Ни в коем случае проверку нельзя откладывать на следующий день.

Если переваренные пробы непрозрачные либо если они не проверены в течение 30 минут после приготовления, то их необходимо очистить их следующим образом:

- итоговую пробу объемом 60 мл выливают в мерный цилиндр и дают отстояться в течение 10 минут; затем 45 мл надосадочной жидкости удаляют отсасыванием, а оставшиеся 15 мл разводят до 45 мл водопроводной водой;

- после дальнейшего 10-минутного периода покоя 30 мл надосадочной жидкости удаляют отсасыванием, а оставшиеся 15 мл переливают в чашку Петри или лоток для подсчета личинок для исследования;

- мерный цилиндр промывают 10 мл водопроводной воды, и эти смывы добавляют к пробе в чашку Петри или в лоток для подсчета личинок для исследования.

IV. Положительные или сомнительные результаты

Если получен положительный или сомнительный результат, то применяют положения, установленные в Главе I(3)(III).

B. Метод переваривания объединенной пробы с использованием механических приспособлений/метод "выделения на фильтре"

1. Оборудование и реактивы

Согласно Разделу A(1).

Дополнительное оборудование:

(a) 1-литровая воронка Гельмана с держателем фильтра (диаметр 45 мм);

(b) фильтровальные диски, состоящие из круглой сетки из нержавеющей стали с отверстиями в 35 микрон (диаметр диска: 45 мм), двух резиновых колец толщиной 1 мм (внешний диаметр: 45 мм, внутренний диаметр: 38 мм) и круглой сетки, расположенной между двумя резиновыми кольцами и прикрепленной к ним с помощью двухкомпонентного клея, подходящего для обоих материалов;

(c) колба Эрленмейера вместимостью 3 литра, снабженная боковой трубкой для отсасывания;

(d) фильтрационный насос;

(e) полиэтиленовые пакеты вместимостью не менее 80 мл;

(f) оборудование для запечатывания полиэтиленовых пакетов;

(g) реннилаза, концентрация 1:150 000 единиц Сокслета на грамм.

2. Отбор проб

Согласно Главе I(2).

3. Процедура

I. Измельчение

Предварительное измельчение образцов мяса в мясорубке улучшит качество процесса переваривания. Если используют электрический измельчитель, то его необходимо приводить в действие три-четыре раза, каждый раз приблизительно в течение одной секунды.

II. Процесс переваривания

Данная процедура используется для полных объединенных образцов (пробы общей массой 100 г) или для объединенных образцов массой менее 100 г.

(a) Полные объединенные образцы (пробы общей массой 100 г):

См. Раздел A(3)(II)(a).

(b) Меньшие объединенные образцы (менее 100 проб):

См. Раздел A(3)(II)(b).

III. Выделение личинок в посредством фильтрации

(a) К пищеварительной жидкости добавляют лед (300 - 400 г чешуйчатого или дробленого льда), чтобы довести общий объем до 2 литров. В случае работы с меньшими объединенными образцами количество льда пропорционально уменьшают.

(b) Пищеварительную жидкость размешивают до тех пор, пока лед не растает. Затем охлажденную пищеварительную жидкость оставляют не менее чем на три минуты, чтобы личинки свернулись.

(c) Воронку Гельмана, снабженную держателем фильтра и фильтровальным диском, устанавливают на колбу Эрленмейера, соединенную с фильтрационным насосом.

(d) Пищеварительную жидкость выливают в воронку Гельмана и фильтруют. К концу фильтрации можно облегчить прохождение пищеварительной жидкости через фильтр, применяя отсасывание фильтрационным насосом. Отсасывание необходимо прекратить до того, как фильтр высохнет, т.е. когда в воронке осталось 2 - 5 мл жидкости.

(e) После того как пищеварительная жидкость была отфильтрована, фильтровальный диск изымают и помещают в полиэтиленовый пакет вместимостью 80 мл вместе с 15 - 20 мл раствора реннилазы. Раствор реннилазы приготавливают путем добавления 2 г реннилазы в 100 мл водопроводной воды.

(f) Полиэтиленовый пакет запечатывают дважды и помещают между внешним и внутренним пакетами гомогенизатора Stomacher.

(g) При помощи гомогенизатора Stomacher размельчают содержимое в течение 3 минут, например, во время работы аппарата с полными или неполными объединенными образцами.

(h) Через три минуты полиэтиленовый пакет, содержащий фильтровальный диск и раствор реннилазы, извлекают из гомогенизатора и вскрывают ножницами. Жидкое содержимое выливают в лоток для подсчета личинок или чашку Петри. Пакет ополаскивают 5 - 10 мл воды, которые затем добавляют в лоток для подсчета личинок для исследования с помощью трихинеллоскопа или в чашку Петри для исследования с помощью стереомикроскопа.

(i) Переваренные пробы проверяют сразу после их получения. Ни в коем случае проверку нельзя откладывать на следующий день.

Примечание: Фильтровальные диски нельзя использовать, если они не являются абсолютно чистыми. Грязные диски ни в коем случае нельзя высушивать. Фильтровальные диски можно очистить, оставив их в растворе реннилазы на ночь. Перед использованием такие диски необходимо промыть в свежеприготовленном растворе реннилазы с использованием гомогенизатора Stomacher.

IV. Положительные или сомнительные результаты

Если получен положительный или сомнительный результат, то применяют положения, установленные в Главе I(3)(III).

C. Метод автоматического переваривания для объединенных проб весом до 35 грамм

1. Оборудование и реактивы

(a) Нож или ножницы для нарезки проб.

(b) Поддоны, разделенные на 50 квадратов, в каждый из которых можно поместить образец мяса весом приблизительно 2 г, или другие инструменты, которые обеспечивают эквивалентные гарантии в отношении прослеживаемости образцов.

(c) Измельчитель Trichomatic 35 с фильтровальным устройством.

(d) Раствор соляной кислоты 8,5% 0,5% веса.

(e) Прозрачные поликарбонатные мембранные фильтры диаметром 50 мм, с размером ячеек 14 микрон.

(f) Пепсин, концентрация: 1:10000 NF (Национальный формуляр США), соответствующая 1:12500 ВР (Британская фармакопея) и 2000 FIP (Международная федерация фармацевтов), или стабилизированный жидкий пепсин с концентрацией минимум 660 Европейских фармакопейных единиц на мл.

(g) Весы с точностью не менее 0,1 г.

(h) Пинцет с плоским наконечником.

(i) Несколько предметных стекол для микроскопа с боковой длиной не менее 5 см или несколько чашек Петри диаметром не менее 6 см, дно которых размечено на квадраты 10 х 10 мм с помощью острого инструмента.

(j) (Стерео)микроскоп с проходящим светом (увеличение от 15 до 60 раз) или трихинеллоскоп с горизонтальным столом.

(k) Емкость для сбора жидких отходов.

(l) Несколько 10-литровых емкостей для обеззараживания оборудования, например, формальдегидом, и для желудочного сока, оставшегося после тестирования положительных проб.

(m) Термометр с точностью до 0,5°C в пределах от 1 до 100°C.

2. Отбор проб

Согласно Главе I(2).

3. Процедура

I. Процедура переваривания

(a) Устанавливают измельчитель с фильтрующим устройством, подсоединяют трубку для отходов и размещают вывод трубки в емкость для сбора отходов.

(b) Когда измельчитель включен, начинают нагревание.

(c) До включения, необходимо открыть и закрыть нижний клапан, расположенный под реакторной камерой.

(d) Затем добавляют до 35 проб, весом приблизительно 1 г каждая (при 25 - 30°С), взятых от каждой отдельной пробы в соответствии с пунктом 2. Необходимо удостовериться, что более крупные куски сухожилий удалены, поскольку они могут засорить мембранный фильтр.

(e) Жидкостную камеру, соединенную с измельчителем, наполняют до краев водой (приблизительно 400 мл).

(f) Меньшую соединенную жидкостную камеру наполняют до краев приблизительно 30 мл соляной кислоты (8,5%).

(g) Мембранный фильтр помещают под крупнодисперсный фильтр в держатель фильтра в фильтрующее устройство.

(h) В последнюю очередь добавляют 7 г пепсина или 21 мл жидкого пепсина. Необходимо строго соблюдать данный порядок, чтобы не допустить распада пепсина.

(i) Закрывают крышки реакторной и жидкостной камер.

(j) Выбирают период переваривания. Короткий период переваривания (5 минут) должен быть установлен для свиней, подвергшихся убою в обычном возрасте, а для других образцов - более долгий период (8 минут).

(k) Когда на измельчителе включена кнопка старт, автоматически запускается процесс размельчения и переваривания, который затем переходит в фильтрование. Через 10 - 13 минут процесс завершается и останавливается автоматически.

(l) Крышку реакторной камеры открывают, предварительно удостоверившись, что камера пуста. Если в камере осталась пена или пищеварительная жидкость, процедуру повторяют в соответствии с Разделом V.

II. Выделение личинок

(a) Держатель фильтра вынимают, мембранный фильтр переносят на предметное стекло или чашку Петри.

(b) Мембранный фильтр исследуют с помощью (стерео)микроскопа или трихинеллоскопа.

III. Оборудование для очистки

(a) Если результат положительный, реакторную камеру измельчителя наполняют на две трети кипящей водой. В присоединенную жидкостную камеру наливают обыкновенную водопроводную воду до уровня, покрывающего нижний датчик. Затем происходит автоматическая очистка. Держатель фильтра и все остальное оборудование обеззараживают, например, с помощью формальдегида.

(b) В конце дня, после того, как работа завершена, жидкостную камеру измельчителя наполняют водой и включают измельчитель на стандартный цикл.

IV. Использование мембранных фильтров

Каждый поликарбонатный мембранный фильтр можно использовать не более пяти раз. Фильтр необходимо переворачивать после каждого использования. После каждого использования также необходимо проверять фильтр на наличие повреждений, которые могут привести фильтр в негодность.

V. Метод, подлежащий применению, если переваривание не полное и невозможно провести фильтрацию

Как только измельчитель завершил автоматический цикл в соответствии с Разделом I, открывают крышку реакторной камеры и проверяют камеру на наличие пены или другой жидкости, оставшейся в камере. Если наличие обнаружено, необходимо сделать следующее:

(a) закрыть нижний клапан реакторной камеры;

(b) вынуть держатель фильтра и перенести мембранный фильтр на предметное стекло или чашку Петри;

(c) вставить новый мембранный фильтр в держатель фильтра и прикрепить держатель фильтра;

(d) наполнить жидкостную камеру измельчителя водой до уровня, покрывающего нижний датчик;

(e) провести автоматический цикл очистки;

(f) после окончания цикла очистки открыть крышку реакторной камеры и проверить на наличие остатков жидкости;

(g) если камера пуста, вынуть держатель фильтра и с помощью пинцета перенести мембранный фильтр на предметное стекло или чашку Петри;

(h) исследовать два мембранных фильтра в соответствии с Разделом II. Если фильтры нельзя исследовать, повторить процесс переваривания целиком с более длительным периодом переваривания в соответствии с Разделом I.

VI. Положительные или сомнительные результаты

Если получен положительный или сомнительный результат, то применяют положения, установленные в Главе I(3)(III).

D. Метод переваривания объединенных проб с использованием магнитной мешалки/метод "выделения на фильтре" и выявление личинок методом реакции латекс-агглютинации

Данный метод является эквивалентным только для исследования мяса домашних свиней

1. Оборудование и реактивы

(a) Нож или ножницы и пинцет для отбора проб.

(b) Поддоны, разделенные на 50 квадратов, в каждый из которых можно поместить образец мяса весом приблизительно 2 г, или другие инструменты, которые обеспечивают эквивалентные гарантии в отношении прослеживаемости образцов.

(c) Измельчитель с острым рубящим лезвием. Если образцы весят больше 3 г, используется мясорубка с отверстиями диаметром 2 - 4 мм или ножницы. Для замороженного мяса или языка (после удаления поверхностного слоя, который не поддается перевариванию) необходимо использовать мясорубку и существенно увеличить размер пробы.

(d) Магнитные мешалки с термопластинами, регулирующими температуру, и магнитными палочками с тефлоновым покрытием длиной приблизительно 5 см.

(e) Лабораторные стаканы из стекла, вместимостью 3 литра.

(f) Сетчатые фильтры с размером ячеек 180 микрон, внешним диаметром 11 см, с ячейками из нержавеющей стали.

(g) Стальное фильтровальное устройство для сетчатых фильтров размером 20 m, со стальной воронкой.

(h) Вакуумный насос.

(i) Металлические или пластмассовые емкости объемом 10 - 15 литров для сбора желудочного сока

(j) Трехмерный смеситель.

(k) Алюминиевая фольга.

(l) 25% соляная кислота.

(m) Пепсин, концентрация: 1:10000 NF (Национальный формуляр США), соответствующая 1:12500 ВР (Британская фармакопея) и 2000 FIP (Международная федерация фармацевтов), или стабилизированный жидкий пепсин с концентрацией минимум 660 Европейских фармакопейных единиц на мл.

(n) Водопроводная вода, нагретая до 46 - 48°C.

(o) Весы с точностью до 0,1 г.

(p) Пипетки различных размеров (1, 10 и 25 мл), микропипетки согласно инструкциям производителя тестов латекс-агглютинации и держатели для пипеток.

(q) Нейлоновые сетчатые фильтры с размером ячеек 20 микрон и диаметром, подходящим для системы фильтрации.

(r) Пинцет из пластмассы или стали длиной 10 - 15 см.

(s) Конические тубы вместимостью 15 мл.

(t) Пестик с коническим наконечником из тефлона или стали, подходящий для конических туб.

(u) Термометр с точностью до 0,5°C в пределах от 1 до 100°C.

(v) Карты для латекс-агглютинации из набора для анализа на антиген Trichin-L, утвержденного под кодом N EURLP_D_001/2011.

(w) Буферный раствор с консервантом (растворитель) из набора для анализа на антиген Trichin-L, утвержденного под кодом N EURLP_D_001/2011.

(x) Буферный раствор, дополненный консервантом (отрицательная контрольная проба), из набора для анализа на антиген Trichin-L, утвержденного под кодом N EURLP_D_001/2011.

(y) Буферный раствор с антигенами Trichinella spiralis и консервантом (положительная контрольная проба), из набора для анализа на антиген Trichin-L, утвержденного под кодом N EURLP_D_001/2011.

(z) Буферный раствор с частицами полистирола, покрытыми антителами (латексные гранулы), дополненный консервантом, из набора для анализа на антиген Trichin-L, утвержденного под кодом N EURLP_D_001/2011.

(aa) Одноразовые палочки.

2. Отбор проб

Согласно Главе I(2).

3. Процедура

I. Полные объединенные образцы (пробы общей массой 100 г)

(a) 16 0,5 мл 25% соляной кислоты (0,2% готовой) добавляют в 3-литровый лабораторный стакан, содержащий 2 литра 200 мл водопроводной воды, предварительно нагретой до температуры 46 - 48°C; в стакан помещают магнитную палочку, а сам стакан помещают на предварительно нагретую пластину и начинают перемешивание.

(b) Добавляют 10 1 г порошкового пепсина (или 30 3 мл жидкого пепсина).

(c) 100 - 115 г проб, отобранных в соответствии с пунктом 2, измельчают на мясорубке вместе с 150 15 мл предварительно нагретого буферного раствора.

(d) Измельченное мясо помещают в 3-литровый лабораторный стакан, содержащий воду, пепсин и соляную кислоту.

(e) Насадку для измельчения несколько раз погружают в пищеварительную жидкость в лабораторном стакане, чашу измельчителя ополаскивают небольшим количеством пищеварительной жидкости, чтобы удалить остатки мяса.

(f) Лабораторный стакан накрывают алюминиевой фольгой.

(g) Магнитную мешалку необходимо настроить таким образом, чтобы поддерживать постоянную температуру в пределах 44 - 46°C на протяжении всего процесса. В процессе перемешивания пищеварительная жидкость должна вращаться на достаточно высокой скорости для образования водоворота без разбрызгивания.

(h) Пищеварительную жидкость размешивают до полного растворения частиц мяса (приблизительно 30 минут). Затем мешалку выключают, а пищеварительную жидкость сливают через сетчатый фильтр в воронку для отстаивания осадка. Могут потребоваться более длительные периоды переваривания (не превышающие 60 минут) при обработке некоторых видов мяса (язык, мясо дичи и пр.).

(i) Процесс переваривания считают удовлетворительным, если на сетчатом фильтре осталось не более 5% от исходного веса пробы.

(j) Нейлоновый фильтр с размером ячеек 20 микрон устанавливают на держателе фильтра. Коническую воронку для фильтрации устанавливают на держателе с помощью системы блокирования, а сетчатый фильтр с размером ячеек 180 микрон помещают в воронку. Вакуумный насос подключается к держателю фильтра и к металлической или пластмассовой емкости для сбора пищеварительной жидкости.

(k) Перемешивание прекращают, а пищеварительную жидкость пропускают через сетчатый фильтр в воронку для фильтрации. Лабораторный стакан ополаскивают 250 мл теплой воды. Ополаскивающую жидкость выливают в фильтровальное устройство после успешной фильтрации пищеварительной жидкости.

(l) Мембранный фильтр берут за край с помощью пинцета. Мембранный фильтр складывают (минимум) в четыре раза и помещают в 15 мл коническую тубу. Выбор конической тубы зависит от выбора пестика.

(m) Мембранный фильтр опускают на дно 15 мл конической тубы с помощью пестика и сильно прижимают 20 последовательными возвратно-поступательными движениями пестика, который должен быть размещен в пределах сложенного мембранного фильтра в соответствии с инструкциями производителя.

(n) С помощью пипетки добавляют 0,5 0,01 мл растворителя пробы в 15 мл коническую тубу, а мембранный фильтр гомогенизируют возвратно-поступательными движениями пестика, небольшой амплитуды, на протяжении примерно 30 секунд, избегая резких движений для ограничения разбрызгивания, в соответствии с инструкциями производителя.

(o) Каждый образец, отрицательную и положительную контрольные пробы распределяют с помощью пипетки в разные поля карты для латекс-агглютинации в соответствии с инструкциями производителя.

(p) В каждое поле карты для латекс-агглютинации с помощью пипетки добавляют латексные гранулы в соответствии с инструкциями производителя, не допуская контакта гранул с образцами и контрольными пробами. В каждом поле латексные гранулы слегка перемешивают с помощью одноразовой палочки до тех пор, пока однородная жидкость не покроет все поле.

(q) Карту для латекс-агглютинации помещают в трехмерный смеситель и вращают в течение 10 1 минут в соответствии с инструкциями производителя.

(r) По истечении периода времени, установленного инструкциями производителя, вращение останавливают, карту для латекс-агглютинации помещают на плоскую поверхность и сразу считывают результаты реакции в соответствии с инструкциями производителя. В случае положительной пробы должны образоваться агрегаты-гранулы. В случае отрицательной пробы суспензия остается однородной без образования агрегатов.

II. Объединенные образцы массой менее 100 г, как указано в Главе I(3)(II)

При работе с объединенными образцами массой менее 100 г необходимо следовать процедуре, указанной в Главе I(3)(II).

III. Положительные или сомнительные результаты

Если в итоге проверки объединенной пробы получают положительный или сомнительный результат латекс-агглютинации, то от каждой свиньи отбирают новую пробу весом 20 г в соответствии с Главой I(2)(a). Двадцатиграммовые пробы, полученные от пяти свиней, объединяют и проверяют с использованием метода, описанного в Разделе I. Таким способом проверяют пробы от 20 групп по 5 свиней в каждой.

В случае если проверка нового объединенного образца от пяти свиней показывает положительный результат латекс-агглютинации, то от каждого животного данной группы отбирают новую пробу весом 20 г, и проверяют каждую пробу отдельно с использованием метода, описанного в Разделе I.

Если получают положительный или сомнительный результат латекс-агглютинации, не менее 20 г свиных мышц должно быть отправлено в национальную справочную лабораторию для проверки одним из методов, описанных в Главе I.

Пробы, содержащие паразитов, необходимо хранить в 90% этиловом спирте для сохранения и идентификации видов в справочной лаборатории ЕС или в национальной справочной лаборатории.

После сбора паразитов положительные жидкости необходимо обеззаразить путем нагревания до температуры не ниже 60°С.

IV. Процедура очистки и обеззараживания после положительного или сомнительного результата

Если в итоге проверки объединенной или индивидуальной пробы получают положительный или сомнительный результат латекс-агглютинации, то все материалы, которые вступали в контакт с мясом (чаша и нож измельчителя, пестик, лабораторный стакан, магнитная палочка, датчик температуры, коническая фильтрационная воронка, фильтр и пинцет), должны быть тщательно обеззаражены путем погружения на несколько секунд в теплую воду (65 - 90°C). Остатки мяса или неактивные личинки, которые могут остаться на их поверхности, можно удалить с помощью чистой губки и водопроводной воды. При необходимости можно добавить несколько капель моющего средства для обезжиривания оборудования. Затем рекомендуется тщательно промыть каждый элемент, чтобы смыть все остатки моющего средства.

E. Тест искусственного переваривания для выявления in vitro личинок Trichinella spp. в пробах мяса, комплект PrioCHECK Trichinella AAD

Данный метод является эквивалентным только для исследования мяса домашних свиней

Комплект PrioCHECK Trichinella AAD используется в соответствии с инструкцией к данному комплекту с применением сепарационных воронок (Lenz NS 29/32) и стеклянной пробирки объемом 80 мл.