Глава I. Эталонный метод обнаружения

Глава I
Эталонный метод обнаружения

Метод переваривания объединенной пробы с использованием магнитной мешалки

1. Оборудование и реактивы

(a) Нож или ножницы и пинцет для отбора проб.

(b) Поддоны, разделенные на 50 квадратов, в каждый из которых можно поместить образец мяса весом приблизительно 2 г, или другие инструменты, которые обеспечивают эквивалентные гарантии в отношении прослеживаемости образцов.

(c) Измельчитель с острым рубящим лезвием. Если образцы весят больше 3 г, используется мясорубка с отверстиями диаметром 2 - 4 мм или ножницы. Для замороженного мяса или языка (после удаления поверхностного слоя, который не поддается перевариванию) необходимо использовать мясорубку и существенно увеличить размер пробы.

(d) Магнитные мешалки с термопластинами, регулирующими температуру, и магнитными палочками с тефлоновым покрытием длиной приблизительно 5 см.

(e) Конические стеклянные сепарационные воронки объемом минимум 2 литра, предпочтительно оснащенные предохранительными пробками с тефлоновым покрытием.

(f) Стойки, кольца и зажимы.

(g) Сетчатые фильтры с размером ячеек 180 микрон, внешним диаметром 11 см, с ячейками из нержавеющей стали.

(h) Воронки, с внутренним диаметром не менее 12 см для поддержки сетчатых фильтров.

(i) Лабораторные стаканы из стекла вместимостью 3 литра.

(j) Стеклянные мерные цилиндры вместимостью 50 - 100 мл или центрифужные пробирки.

(k) Трихинеллоскоп с горизонтальным столом или стереомикроскоп с платформой проходящего света регулируемой интенсивности.

(l) Несколько чашек Петри диаметром 9 см (для использования со стереомикроскопами), дно которых размечено на квадраты 10 х 10 мм с помощью острого инструмента.

(m) Лоток для подсчета личинок (для использования с трихинеллоскопом), сделанный из акриловых пластин толщиной 3 мм, со следующими параметрами:

(i) дно лотка размером 180 х 40 мм размечено на квадраты;

(ii) боковые стороны: 230 х 20 мм;

(iii) торцевые стороны: 40 х 20 мм. Дно и торцевые стороны необходимо зафиксировать между боковыми сторонами, чтобы образовать две небольшие рукоятки у краев. Верхняя часть дна должна быть поднята на 7-9 мм от основания рамки, образованной боковыми и торцевыми сторонами. Компоненты должны быть скреплены вместе клеем, подходящим для данного материала.

(n) Алюминиевая фольга.

(o) 25% соляная кислота.

(p) Пепсин, концентрация: 1:10000 NF (Национальный формуляр США), соответствующая 1:12500 ВР (Британская фармакопея) и 2000 FIP (Международная федерация фармацевтов), либо стабилизированный жидкий пепсин с концентрацией минимум 660 Европейских фармакопейных единиц на мл.

(q) Водопроводная вода, нагретая до 46 - 48°C.

(r) Весы с точностью не менее 0,1 г.

(s) Металлические лотки вместимостью 10 - 15 литров для сбора остатков желудочного сока.

(t) Пипетки различных размеров (1, 10 и 25 мл) и держатели для пипеток.

(u) Термометр с точностью до 0,5°C в пределах от 1 до 100°C.

(v) Сифон для водопроводной воды.

2. Отбор проб и количество, подлежащее перевариванию

(a) Для исследования целых туш домашних свиней отбирают пробу весом не менее 1 г из ножки диафрагмы на границе перехода мышечной ткани в сухожилие. Можно использовать специальные изогнутые ножницы, если гарантируется точность в диапазоне между 1,00 г и 1,15 г.

Для исследования воспроизводящих свиноматок и хряков из ножки диафрагмы отбирают более крупную пробу весом не менее 2 г на границе перехода мышечной ткани в сухожилие.

Если пробу из ножек диафрагмы взять невозможно, то отбирают пробу в два раза больше 2 г (или 4 г для исследования воспроизводящих свиноматок и хряков) из реберной или грудной части диафрагмы либо из жевательных мышц, мышц языка или пищевода.

(b) Для исследования частей туш отбирают пробы из поперечнополосатой мышцы весом не менее 5 г, содержащие малое количество жира, и, если это возможно, из близко расположенных к ребрам или сухожилиям участков. Пробу такого же размера отбирают из мяса, не предназначенного для тщательной тепловой обработки или других видов послеубойной обработки.

(c) Для исследования замороженных образцов отбирают пробу весом не менее 5 г из поперечнополосатой мышечной ткани.

Вес проб мяса относится к пробе мяса без какого-либо жира и оболочки. Особое внимание необходимо уделять отбору проб из мышц языка во избежание загрязнения с поверхностного слоя языка, который не поддается перевариванию и может препятствовать анализу осадка.

3. Процедура

I. Полные объединенные образцы (пробы общей массой 100 г)

(a) 16 0,5 мл соляной кислоты добавляют в 3-литровый лабораторный стакан, содержащий 2 литра водопроводной воды, предварительно нагретой до температуры 46 - 48°C; в стакан помещают магнитную палочку, а сам стакан помещают на предварительно нагретую пластину и начинают перемешивание.

(b) Добавляют 10 0,2 г пепсина или 30 0,5 мл жидкого пепсина.

(c) 100 г проб, отобранных в соответствии с пунктом 2, измельчают в мясорубке.

(d) Измельченное мясо помещают в 3-литровый лабораторный стакан, содержащий воду, пепсин и соляную кислоту.

(e) Режущую насадку измельчителя несколько раз погружают в пищеварительную жидкость в лабораторном стакане, чашу измельчителя ополаскивают небольшим количеством пищеварительной жидкости, чтобы удалить остатки мяса.

(f) Лабораторный стакан накрывают алюминиевой фольгой.

(g) Магнитную мешалку необходимо настроить таким образом, чтобы поддерживать постоянную температуру в пределах 44 - 46°C на протяжении всего процесса. В процессе перемешивания пищеварительная жидкость должна вращаться на достаточно высокой скорости для образования водоворота без разбрызгивания.

(h) Пищеварительную жидкость размешивают до полного растворения частиц мяса (приблизительно 30 минут). Затем мешалку выключают, а пищеварительную жидкость сливают через сетчатый фильтр в воронку для отстаивания осадка. Могут потребоваться более длительные периоды переваривания (не превышающие 60 минут) при обработке некоторых видов мяса (язык, мясо дичи и пр.).

(i) Процесс переваривания считают удовлетворительным, если на сетчатом фильтре осталось не более 5% от исходного веса пробы.

(j) Пищеварительную жидкость отстаивают в воронке в течение 30 минут.

(k) По истечении 30 минут пробу пищеварительной жидкости объемом 40 мл быстро переливают в мерный цилиндр или центрифужную пробирку.

(l) Пищеварительные жидкости или другие жидкие отходы хранят в поддоне, пока не завершится считывание результатов.

(m) Пробу объемом 40 мл отстаивают в течение 10 минут. 30 мл надосадочной жидкости осторожно снимают путем отсасывания, чтобы удалить верхние слои и оставить объем не более 10 мл.

(n) Оставшиеся 10 мл пробы осадка выливают в лоток для подсчета личинок или чашку Петри.

(o) Цилиндр или центрифужную пробирку ополаскивают водопроводной водой объемом не более 10 мл, которую необходимо добавить к пробе в лоток для подсчета личинок или в чашку Петри. Далее пробу исследуют под 15 - 20-кратным увеличением трихинеллоскопа или стереомикроскопа. Допускается визуальное наблюдение с использованием других методик, если исследование положительных контрольных проб показало равнозначные или лучшие результаты по сравнению с традиционными методами визуального наблюдения. Во всех случаях обнаружения подозрительных участков или форм, напоминающих паразитов, необходимо использовать более сильное увеличение (60 - 100-кратное).

(p) Переваренные пробы проверяют сразу после их получения. Ни в коем случае проверку нельзя откладывать на следующий день.

Если переваренные пробы не проверены в течение 30 минут после приготовления, то их необходимо очистить их следующим образом. Итоговую пробу объемом приблизительно 40 мл выливают в мерный цилиндр и дают отстояться в течение 10 минут. Затем 30 мл надосадочной жидкости удаляют, оставляя объем 10 мл. Этот объем разводят до 40 мл водопроводной водой. После дальнейшего 10-минутного периода покоя 30 мл надосадочной жидкости удаляют отсасыванием, оставляя объем не более 10 мл для проверки в чашке Петри или лотке для подсчета личинок. Мерный цилиндр промывают не более чем 10 мл водопроводной воды, и эти смывы добавляют для исследования к пробе в чашку Петри или в лоток для подсчета личинок.

Если в ходе проверки осадок оказывается недостаточно прозрачным, то пробу выливают в мерный цилиндр и разводят до 40 мл водопроводной водой, а затем проводят процедуру, описанную в настоящем Разделе. Процедуру можно повторить от 2 до 4 раз, пока жидкость не станет достаточно прозрачной для проведения точного считывания результатов.

II. Объединенные образцы массой менее 100 г

При необходимости можно добавить не более 15 г к объединенному образцу весом 100 г, исследовать их совместно с данными пробами в соответствии с Разделом I. Более 15 г необходимо исследовать как полный объединенный образец. Для объединенных образцов весом до 50 г объем пищеварительной жидкости и ингредиентов можно сократить до 1 литра воды, 8 мл соляной кислоты и 5 г пепсина.

III. Положительные или сомнительные результаты

Если в итоге проверки объединенного образца получают положительный или сомнительный результат, то от каждой свиньи отбирают новую пробу весом 20 г в соответствии с пунктом 2(a). Двадцатиграммовые пробы, полученные от пяти свиней, объединяют и проверяют с использованием метода, описанного в настоящей Главе. Таким способом проверяют пробы из 20 групп по 5 свиней в каждой.

В случае если в объединенной пробе от пяти свиней обнаруживают Trichinella, то от каждого животного данной группы отбирают новую пробу весом 20 г и проверяют каждую пробу отдельно с использованием метода, описанного в настоящей Главе.

Пробы, содержащие паразитов, необходимо хранить в 90% этиловом спирте для сохранения и идентификации видов в справочной лаборатории ЕС или в национальной справочной лаборатории.

После сбора паразитов положительные жидкости (желудочный сок, надосадочная жидкость, смывы и пр.) необходимо обеззаразить путем нагревания до температуры не ниже 60°С.

IV. Процедура очистки и обеззараживания после положительного или сомнительного результата

Если в итоге проверки объединенного или индивидуального образца получают положительный или сомнительный результат, то все материалы, которые вступали в контакт с мясом (чаша и нож измельчителя, лабораторный стакан, магнитная палочка, датчик температуры, коническая фильтрационная воронка, фильтр и пинцет), должны быть тщательно обеззаражены путем промывания в теплой воде (65 - 90°C). Рекомендуется тщательно промывать каждый элемент, чтобы смыть моющее средство, в случае его использования во время промывания.