Приложение А (справочное). Примеры результатов секвенирования ДНК

Приложение А
(справочное)

Примеры результатов секвенирования ДНК

А.1 Примеры результатов секвенирования ДНК, возможные причины неудачных испытаний и пути устранения проблем приведены в таблице А.1.

Таблица А.1

N п/п	Полученный результат	Фрагмент хроматограммы	Возможные причины	Устранение проблем
1	Интенсивность сигнала высокая, пики хорошо разделены		Норма	-
2	Сигнал чтения матрицы ДНК идет на фоне выраженного шума прибора, "слабый сигнал"		Недостаточное количество матрицы в анализируемой пробе	Увеличение концентрации ДНК матрицы на этапе проведения реакции секвенирования
3	Отсутствие выраженных пиков, сигнал на уровне шума прибора		1) В реакционную смесь не добавлен один из компонентов: готовая смесь для секвенирования, матрица или праймер. 2) Недостаточное количество матрицы в анализируемой пробе. 3) Праймер не комплементарен данной матрице	Повторение испытания с этапа проведения реакции секвенирования. В случае воспроизведения неудачного результата испытание повторяют с этапа выделения ДНК
4	Основной сигнал чтения матрицы ДНК идет на фоне более или менее выраженного второго сигнала или нескольких сигналов		1) Нарушение режима ПЦР, приводящее к появлению неспецифических продуктов амплификации. 2) Анализируемая проба не является однокомпонентной продукцией	1) Повторное испытание анализируемой пробы, начиная с этапа ПЦР. 2) Проба не подлежит испытанию
5	Пики очень высокой интенсивности в начале хроматограммы, быстрое падение сигнала, короткое прочтение матрицы		Перегрузка реакционной смеси ДНК матрицей, в результате чего нарабатывается одновременно слишком много коротких фрагментов, амплификация длинных фрагментов тормозится недостатком флуоресцентно-меченых ддНТФ	Уменьшение концентрации ДНК матрицы на этапе проведения реакции секвенирования
6	Перегрузка короткими фрагментами матрицы (20-40 п. н.) в начале хроматограммы, далее высота пиков резко снижается		Присутствие в анализируемой пробе большого количества димеров праймеров, образовавшихся в результате ПЦР	Повторение испытания, начиная с этапа ПЦР. Улучшение качества очистки ДНК матрицы для секвенирования (например, вырезание фрагмента основного продукта ПЦР из агарозного геля)
7	Пики на хроматограмме слева имеют крутые края, а справа - пологие		Загрязнение матрицы побочными веществами, например, солями	Повторяют испытание с этапа очистки ПЦР продукта, используют альтернативные методы очистки (например, переосаждение ДНК этиловым спиртом в присутствии ацетата калия)
8	Всплески флюоресценции несвязавшихся во время ПЦР-реакции флюоресцентно-меченых терминаторов		Недостаточно эффективная очистка реакционной смеси от несвязавшихся флюоресцентно-меченых терминаторов	Оптимизация условий реакции секвенирования. Оптимизация условий очистки реакционной смеси, использование других доступных наборов реагентов
9	Появление в произвольном месте узкого и высокого пика всех четырех цветов		Попадание в капилляр кристалла полимера, дефект электрофореза	Повторение этапа капиллярного электрофореза анализируемой пробы
10	Размывание пиков на хроматограмме		Ухудшение качества полимера, истощение буферного раствора, загрязнение капилляров	Проведение технического обслуживания анализатора с заменой буфера и полимера. Повторение этапа капиллярного электрофореза анализируемой пробы