Методические указания МУК 4.1.2786-10 "Определение остаточных количеств дифеноконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 ноября 2010 г.)

Методические указания МУК 4.1.2786-10
"Определение остаточных количеств дифеноконазола в семенах, масле и зеленой массе рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24 ноября 2010 г.)

Дата введения: с момента утверждения
Введены впервые

Общие положения

Свидетельство об аттестации методики N 0037.16.07.10 от 19.07.2010.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств дифеноконазола в семенах рапса в диапазоне 0,02-0,2 мг/кг, в зеленой массе и масле рапса в диапазоне 0,05-0,5 мг/кг.

Название вещества по ИСО: Дифеноконазол

Название вещества по ИЮПАК: 4-хлорфениловый эфир cis,trans-3-хлор-4-[4-метил-2-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)-1,3-диоксолан- 2-ил]фенила

Мол. масса: 406,3.

Кристаллическое вещество от белого до светло-бежевого цвета. Температура плавления: 78,6°С. Давление паров при 25°С: мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость при 25°С: этанол - 330, ацетон - 610, толуол - 490, н-гексан - <3,4, н-октанол - 95, вода - 0,015.

Вещество устойчиво к гидролизу и фотолизу (при естественном солнечном свете дней).

Дифеноконазол быстро сорбируется почвой и медленно разрушается.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс - 1 453, для мышей - >2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность для кроликов - >2 010 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - >3 300 воздуха. для рыб 0,8-1,2 (96 ч). Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел и дождевых червей.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в свекле сахарной, яблоках и грушах - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - не допускается в пределах чувствительности метода контроля.

Область применения препарата

Дифеноконазол - системный фунгицид и протравитель семян. Обладает длительным защитным и лечебным действием против широкого круга растительных патогенов из классов аскомицетов, базидиомицетов, дейтеромицетов, включая возбудителей альтернариоза, септориоза, церкоспороза, парши, антракноза, ржавчины, мучнистой росы, а также некоторых патогенов, обитающих на семенах пшеницы, сахарной свеклы, картофеля, семечковых плодовых и овощных культур.

Применяется в России в качестве составного компонента комбинированных протравителей для предпосевной обработки семян сахарной свеклы, зерновых колосовых культур и рапса при норме расхода 45-60 г д.в./т семян, а также используется для обработки вегетирующих растений сахарной и столовой свеклы, картофеля, моркови и рапса, яблоневых и грушевых садов с нормой расхода до 100 г д.в./га.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 1

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (граница относительной погрешности), , % Р = 0,95	Стандартное отклонение повторяемости, , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
Зеленая масса	от 0,05 до 0,1 вкл.	50	1,9	5	6
	более 0,1 до 0,5	25	2,5	7	8
Семена	от 0,02 до 0,1 вкл.	50	3,2	9	11
	более 0,1 до 0,2	25	2,6	7	9
Масло	от 0,05 до 0,1 вкл.	50	2,2	6	7
	более 0,1 до 0,5	25	2,3	6	8

Таблица 2

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения вещества, %	Стандартное отклонение, S, %	Доверительный интервал среднего результата,
Зеленая масса	0,05	0,05-0,5	85,3	2,9	2,7
Семена	0,02	0,02-0,2	85,5	3,1	2,9
Масло	0,05	0,05-0,5	84,7	2,9	2,7

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным детектором (ЭЗД). Контроль дифеноконазола в матрицах осуществляется по содержанию вещества после экстракции его из зеленой массы водным ацетоном, из семян водным метанолом и из масла ацетонитрилом, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Идентификация вещества проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ЭЗД (СКБ "Хроматэк", Россия)	номер Госреестра N 14516-95
Весы аналитические Sartorius 6110 с наибольшим пределом взвешивания до 110 г и пределом допустимой погрешности 0,0001 г	ГОСТ 24104-2001
Весы лабораторные Metler Р-160 с наибольшим пределом взвешивания до 160 г и пределом допустимой погрешности 0,005 г	ГОСТ 24104-2001
Набор гирь	ГОСТ 7328-2001
Колбы мерные вместимостью 2-100-2; 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5; 1-2-2-10	ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой П-2-5-0,1; П-2-10-0,2	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000	ГОСТ 1770-74
Микрошприц МШ-1А	ТУ 64-1-2850

3.2. Реактивы

Аналитический стандарт дифеноконазола (CAS 119446-68-3) с содержанием основного вещества 99,5% (Сингента, Швейцария)
Ацетон, квалификации чда	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил, квалификации хч	ТУ 6-09-3534-87
Вода дистиллированная или деионизированная	ГОСТ 6709-72
н-Гексан, квалификации хч	ТУ 6-09-3375-78
Калий углекислый, квалификации хч	ГОСТ 4221-76
Калия перманганат, квалификации хч	ГОСТ 20490-75
Кислота серная, квалификации хч	ГОСТ 4204-77
Натрия сульфат, безводный, квалификации хч	ГОСТ 4166-76
Спирт метиловый (метанол), квалификации хч	ГОСТ 6995-77
Эфир диэтиловый, квалификации хч	ТУ 2600-001-45682126-06

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный (баллон), квалификации осч	ГОСТ 9293-74
Аппарат для встряхивания проб АВУ-1	ТУ 64-1-1081-73
Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма Branson Instr. Со. (США)
Вата медицинская гигроскопическая хлопковая, нестерильная	ГОСТ 5556-81
Гомогенизатор "Omni-mixer" (Sorvall, США) или гомогенизатор	МРТУ 42-1505
Дистиллятор Cyclon III, мод. 4 BD (Fistreem, Великобритания)
Установка Elgastat В 114 с патроном Elgacan В 114 для получения деионизированной воды (Elga, Великобритания)
Воронки делительные вместимостью 100	ГОСТ 25336-82
Воронки лабораторные, стеклянные	ГОСТ 25336-82
Воронка Бюхнера	ГОСТ 9147-80
Колба Бунзена	ГОСТ 25336-82
Колбы плоскодонные вместимостью 250	ГОСТ 9737-93
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10, 25 и 100	ГОСТ 9737-93
Колонка хроматографическая, капиллярная кварцевая ZB-1 (типа SE-30), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,5 мкм, фирма Phenomenex (США) или аналогичная
Колонка хроматографическая стеклянная, длиной 25 см, внутренним диаметром 8-10 мм
Мельница лабораторная электрическая	ТУ 46-22-236-84
Патроны концентрирующие Диапак-диол (0,6 г)/ЗАО "БиоХимМак СТ", Москва/	ТУ 4215-001-05451931-94
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi (Швейцария)	ТУ 25-11-917-76
Силикагель (60-80 меш) для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) I степени активности
Стаканы химические вместимостью 100 и 500	ГОСТ 25336-82
Стекловата
Установка для перегонки растворителей с дефлегматором	ГОСТ 9737-93 (ИСО 641-75)
Фильтры бумажные "красная лента", обеззоленные	ТУ 6-09-2678-77
Шприц медицинский с разъемом Льюера вместимостью 20	ГОСТ 22090

Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 3.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей# не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

6. Условия выполнения измерений

6.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- температура воздуха ;

- атмосферное давление (84-106) кПа;

- относительная влажность воздуха не более 80%.

6.2. Условия хроматографического анализа

Температура термостата испарителя 275°С;

Температура детектора 320°С.

Режим программирования температуры колонки:

начальная температура 200°С (2 мин), скорость подъема температуры до 270°С (0 мин) 20°С/мин;

от 270 до 280°С (10 мин), скорость подъема температуры 5°С/мин.

Расход газов:

газа-носителя (азот) 2,5 ;

поддувочного газа через детектор 25 .

Деление потока: 1:1.

Объем вводимой пробы: 1 .

Время удерживания дифеноконазола: 8 мин .

Линейный диапазон детектирования: (0,02-0,4) нг.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем и концентрирующих патронов Диапак-диол.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 л ацетона 10 г и 2 г ).

7.1.3. Очистка силикагеля

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона, высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 5-6 часов и затем активируют при температуре 130°С в течение 5 часов.

7.2. Подготовка и кондиционирование хроматографической колонки

Капиллярную кварцевую колонку ZB-1 (типа SE-30) устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 280°С и скорости газа-носителя 2 в течение 8-10 часов.

7.3. Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак-диол для очистки экстракта

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8-10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 3 г силикагеля I степени активности в 15 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 ацетона и 6 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 .

7.4. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем

При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из колонки с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 помещают 0,2 градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 в смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 7.3. Промывают колонку 30 смеси гексан-ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку пропускают 40 смеси гексан-ацетон (1:1, по объему), отбирая последовательно по 5 элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, сухие остатки растворяют в 1 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан-ацетон (1:1, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида с колонки.

7.5. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания дифеноконазола из патрона Диапак-диол

В круглодонную колбу вместимостью 10 помещают 0,2 градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с концентрацией 2 в смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) (п. 7.6.2). Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 1 смеси гексан-ацетон (9:1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на патрон Диапак-диол, подготовленный по п. 7.3. Промывают патрон 2 смеси гексан-ацетон (9:1, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 20 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), отбирая последовательно по 5 элюата. Каждую фракцию упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С, сухие остатки растворяют в 1 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и затем хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения дифеноконазола в каждой фракции определяют объем смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из патрона.

7.6. Приготовление градуировочных растворов

7.6.1. Исходный раствор дифеноконазола для градуировки с массовой концентрацией 100

В мерную колбу вместимостью 100 помещают г дифеноконазола, растворяют в 40-50 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), доводят объем раствора этой же смесью до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18)°С в течение 3-х месяцев.

7.6.2. Градуировочный раствор дифеноконазола с массовой концентрацией 2 (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 помещают 2 исходного раствора дифеноконазола с массовой концентрацией 100 (п. 7.6.1), разбавляют смесью гексан-ацетон (8:2, по объему) до метки. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов NN 2-5.

Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18)°С в течение месяца.

7.6.3. Градуировочные растворы дифеноконазола с массовой концентрацией (0,02-0,2) (растворы ММ 2-5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 помещают 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 градуировочного раствора N 1 дифеноконазола с массовой концентрацией 2 (п. 7.6.2), доводят до метки смесью гексан-ацетон (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы NN 2-5 с концентрацией дифеноконазола 0,02, 0,04, 0,1 и 0,2 , соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

7.7. Градуировка хроматографа

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации дифеноконазола в растворе , устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м градуировочным растворам (п. 7.6.3).

В испаритель (инжектор) хроматографа вводят по 1 каждого градуировочного раствора (п. 7.6.3) и анализируют при условиях п. 6.2. Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

7.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменения условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

, где

и - значение площади пика дифеноконазола в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике, соответственно, усл. ед.;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

8. Отбор, подготовка и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия".

Пробы зеленой массы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более одного дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре (-18)°С до анализа. Пробы семян высушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4°С.

9. Выполнение определения

9.1. Экстракция дифеноконазола

9.1.1. Зеленая масса. Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 , добавляют 100 смеси ацетон-вода (8:2, по объему) и гомогенизируют 3 мин при 10 000 об/мин. Раствор (с осадком) фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 . Осадок на фильтре промывают 50 смеси ацетон-вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора. Отбирают 1/10 объема экстракта (эквивалентную 2 г образца), переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 и добавляют 20 дистиллированной воды. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.2. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 , добавляют 70 смеси метанол-вода (8:2, по объему) и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу вместимостью 250 . Осадок на фильтре промывают 30 смеси метанол-вода (8:2, по объему). Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 , куда приливают 20 гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин и после разделения фаз гексановую фракцию отбрасывают, а водно-метанольную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 . Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.1.3. Масло. К образцу масла массой 5 г, помещенного в плоскодонную колбу вместимостью 250 , приливают 50 ацетонитрила, перемешивают и колбу помещают на встряхиватель на 40 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в химический стакан через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 25 ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 ацетонитрила. Измеряют объем объединенного ацетонитрильного экстракта и 2/5 его части (эквивалентные 2 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 , куда приливают 15 гексана. Воронку встряхивают в течение 1 мин и после разделения фаз ацетонитрильную фракцию переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40°С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.3.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Экстракты, полученные по пп. 9.1.1 и 9.1.2 и помещенные в круглодонные колбы, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (5-10 ) при температуре не выше 40°С. К водному остатку прибавляют 20 дистиллированной воды, содержимое перемешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 100 . В воронку вносят 30 смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1, по объему), интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После разделения фаз верхний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 . Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 25 смеси гексан-диэтиловый эфир (4:1, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С и подвергают дополнительной очистке на колонке с силикагелем по п. 9.3.

9.3. Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по пп. 9.1.3 и 9.2, растворяют в 0,6 ацетона, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, добавляют 2,4 гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.2. Колбу обмывают 2 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 20 смеси гексан-ацетон (7:3, по объему) со скоростью 1-2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют с колонки 25 смеси гексан-ацетон (1:1, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 . Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°С. Сухой остаток экстрактов зеленой массы и семян растворяют в 5 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10. Экстракт масла дополнительно очищают с помощью концентрирующего патрона Диапак-диол.

9.4. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак-диол

Сухой остаток экстракта масла в круглодонной колбе, полученный по п. 9.3, растворяют с помощью ультразвуковой ванны в 2 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) и переносят в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 7.2). Патрон промывают 2,5 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), элюат отбрасывают. Дифеноконазол элюируют 9 смеси гексан-ацетон (7:3, по объему) в круглодонную колбу вместимостью 25 . Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 30°С. Остаток в колбе растворяют в 5 смеси гексан-ацетон (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин, и анализируют на содержание дифеноконазола по п. 10.

10. Выполнение измерений

10.1. В инжектор хроматографа вводят 1 очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 9.1-9.4), анализируют при условиях (п. 6.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца зеленой массы, семян и масла повторяют операции по пп. 9.1-9.4, 10.1.

11. Обработка результатов измерений

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание дифеноконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

, где

X - содержание дифеноконазола в пробе, мг/кг;

- площадь пика образца, ;

- площадь пика стандарта, ;

А - концентрация стандартного раствора дифеноконазола, ;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, ;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с силикагелем и патроне и последующего хроматографического определения, г.

P - содержание дифеноконазола в аналитическом стандарте, %.

12. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

, где (1)

, - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

13. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности Р = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг ;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг ;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

менее 0,02 мг/кг для семян рапса*.

менее 0,05 мг/кг для зеленой массы и масла рапса**

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал дифеноконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,2 , разбавляют, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержания дифеноконазола учитывают разбавление.

14. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

, где

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг , при этом:

, где

- граница абсолютной погрешности, мг/кг ;

,

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

, где

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 12) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг ;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

, где (3)

, - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг ;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

______________________________

* - 0,02 мг/кг - предел обнаружения для семян.

** - 0,05 мг/кг - предел обнаружения для зеленой массы и масла.

Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

Г.Г. Онищенко