Приложение. Биолюминесцентный метод оценки развития плесневых грибов на полимерных материалах

Приложение
Рекомендуемое

Биолюминесцентный метод оценки развития плесневых грибов на полимерных материалах

Метод распространяется на полимерные материалы (пластмассы, компаунды, резины, клеи, герметики) и их компоненты (полимеры, пластификаторы, наполнители, стабилизаторы, красители, пигменты и т.п.) и позволяет количественно определить степень развития плесневых грибов (далее - грибов) по методам 1, 2, 3 настоящего стандарта.

Сущность метода заключается в получении зависимости количественного показателя развития грибов (концентрация внутриклеточной аденозии-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) на поверхности материала) от времени их культивирования на полимерном материале с последующим определением грибостойкости по кинетическим параметрам развития грибов.

1. Отбор образцов

1.1. Отбор образцов - по п. 1.2.1 настоящего стандарта.

1.2. Количество образцов на один отбор рассчитывают по ГОСТ 9.707, приложение 3.

Если относительная ошибка и вероятность попадания среднего арифметического значения показателя развития грибов в доверительный интервал не заданы, количество проб на один отбор должно быть не менее семи.

2. Аппаратура, материалы, реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - по п. 1.4.1 настоящего стандарта.

Люминомер ЛБ-ЗП, 8702, 8703, 8705, 8707, БХЛ-06. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 10⁴ до 10⁸ квант/с в области спектра 400-600 нм.

Весы для статического взвешивания по ГОСТ 23676.

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 °С.

Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.

Дозаторы для отбора проб 0,01, 0,02, 0,1 см³.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.

Колбы цилиндрические мензурные вместимостью до 25 см³ по ГОСТ 1770.

Пипетки вместимостью 1, 10 см³ по ГОСТ 20292.

Аденозин 5'-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).

Биолюминесцентный АТФ реагент иммолюм.

3. Подготовка к испытаниям

3.1. Образцы подготавливают к испытаниям по пп. 1.5.1-1.5.6 настоящего стандарта.

3.2. Готовят раствор АТФ 1 ммоль/дм³: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм³ разливают по 1 см³ и хранят при температуре минус 20 °С. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 мес.

3.3. Готовят стандартный раствор АТФ 10 мкмоль/дм³: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм³ (по п. 3.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см³ раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см³ дистиллированной воды. Стандартный раствор АТФ готовят непосредственно перед применением.

3.4. Готовят к употреблению биолюминесцентный АТФ реагент иммолюм. В емкость, содержащую АТФ-реагента иммолюм на 10 анализов, добавляют 10 см³ дистиллированной воды суспензию тщательно перемешивают и оставляют стоять при температуре (25  10) °С 2 ч. После этого реагент готов к использованию и может храниться в виде суспензии 7-10 сут в холодильнике при температуре 4 °С.

4. Проведение испытаний

4.1. Заражение и выдерживание образцов - по пп. 1.6.1-1.6.7.

4.2. Отбор образцов для количественного определения показателя развития грибов на материал проводят с периодичностью один раз в сутки. Количество отборов должно быть не менее семи.

4.3. Определение показателя развития грибов прекращают, если концентрация АТФ в последующем отборе не увеличивается по сравнению с предыдущим. Максимальная продолжительность выдержки в условиях по п. 1.6.1-1.6.7 настоящего стандарта - не более 56 сут.

4.4. Готовят экстракт АТФ из биомассы, образовавшейся на образце. Для этого образец помещают в колбу или чашку Петри, добавляют 0,0005-0,002 дм³ диметилсульфоксида (количество фиксируют), чтобы полностью покрыть его поверхность, интенсивно перемешивают 2-3 мин и оставляют стоять при температуре (25  10) °С не менее 3 ч.

4.5. Измеряют интенсивность люминесценции. Для этого в кювету люминометра пипеткой вносят 0,9 см³ суспензии биолюминесцентного АТФ-реагента иммолюм (п. 3.4), предварительно тщательно ее перемешав. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и измеряют фоновое свечение I_фон, затем в ту же кювету вносят дозаторам 0,01-0,1 см³ экстракта АТФ (п. 4.4) и измеряют интенсивность свечения образца I_обр. Затем в ту же кювету вносят дозатором 0,01-0,02 см³ стандартного раствора АТФ (п. 3.3) и измеряют интенсивность свечения I_ст.

5. Обработка результатов

5.1 Концентрацию АТФ (С_i), мкмоль/см², в образце вычисляют по формуле

,

(1)

где С_cт - концентрация стандартного раствора АТФ, равная 10 мкмоль/дм³;

- объем экстракта АТФ, добавленного при измерении интенсивности люминесценции, см³;

- объем стандартного раствора АТФ, добавленного при измерении интенсивности люминесценции, см³;

- объем диметилсульфоксида, используемый для экстракции, см³;

S_i - площадь образца, см³;

i - порядковый номер образца в отборе, i = 1, 2, 3, ..., j;

5.2. Определяют экспериментальную среднюю концентрацию АТФ () в каждом из отборов.

5.3. Данные испытаний заносят в протокол (таблица).

5.4. Лаг-фазу (L_i) устанавливают по промежутку времени до появления С_i, отличной от 0.

Определяют среднюю лаг-фазу (L) и заносят в протокол.

Если разность среднего с минимальным или максимальным значениями экспериментально полученных лаг-фаз превышает 50 %, определяют грибостойкость на новой серии образцов.

5.5. Стойкость полимерных материалов к воздействию грибов определяют по параметрам , K₁, С_max кинетического уравнения, описывающего изменение ,

,

(2)

где - средняя концентрация АТФ, мкмоль/см²;

С_max - максимальная средняя концентрация АТФ, мкмоль/см²;

- средняя экспериментально полученная лаг-фаза;

- продолжительность выдержки, после которой произведен отбор, ч;

K₁ - коэффициент характеризующий удельную скорость развития грибов на материале ч^-1;

K₂ - коэффициент, характеризующий способность споры развиваться на материале при данных условиях;

n - порядковый номер отбора (= 1, 2, ..., q).

Методом наименьших квадратов вычисляют коэффициенты K₁ и K₂ по формулам:

,

(3)

,

(4)

где q - число отборов.

5.6. Определенные по пп. 5.5 коэффициенты K₁ и K₂ подставляют в формулу (2) и находят расчетные значения С_n(расч).

5.7. Рассчитывают среднее квадратическое отклонение () экспериментально полученных значений от расчетных по формуле

.

(5)

Если среди экспериментальных значений имеются , которые не попадают в интервал , то их исключают из данных эксперимента и коэффициенты K₁ и K₂ вновь определяют по п. 5.5 для оставшихся точек. Затем рассчитывают значение и снова исключают экспериментальные точки, не входящие в интервал . Расчет проводят до тех пор, пока все оставшиеся экспериментальные точки будут попадать в интервал при условии, что их количество должно быть не менее пяти. Если экспериментальные данные не удовлетворяют этому требованию, испытания повторяют.

5.8. Оставшиеся для расчета экспериментальные значения , С_max и полученные по п. 5.5 коэффициенты K₁ и K₂ подставляют в формулу (2) и рассчитывают продолжительность лаг-фазы (L_(расч)).

5.9. Чем ниже значение L_(расч) и выше значения и K₁, тем менее стоек полимерный материал к воздействию микроскопических грибов.

Таблица

Протокол
испытаний грибостойкости полимерного материала

1. Наименование, марка материала

2. Завод-изготовитель

3. НТД, по которому выпускается

Номер отбора	Продолжительность выдержки до отбора, ч	Концентрация АТФ (Сi), мкмоль/см2						Средняя концентрация АТФ на образце (), мкмоль/см2	Средняя лаг-фаза, (), ч	Концентрация АТФ максимальная средняя (), мкмоль/см2
		1	2	3	4	...	j
1 2 3 ... q