Приложение 3. Приготовление питательных сред для культивирования лептоспир

Приложение 3

Приготовление питательных сред для культивирования лептоспир

Лептоспиры выращивают на сывороточных средах. Лучшей для изготовления сред является сыворотка крови кроликов и баранов. Сыворотка крови доноров, используемая для приготовления питательной среды, не должна содержать специфических противолептоспирозных антител.

Добавляют сыворотку в количестве 5-10% к дистиллированной, водопроводной, речной, колодезной воде или фосфатному буферу. По этому принципу составлены все жидкие и полужидкие питательные среды. Способствуют росту лептоспир пептон 0,8-1%, гемоглобин 0,05%, витамины группы В, РР по 1 мг на литр среды, камполон (экстракт печени) 0,01% и др.

Изготовление фосфатно-буферных растворов - основы среды

На фосфатном буфере среду готовят только в стеклянной посуде. Сначала готовят маточные растворы из расчета: однозамещенный фосфорнокислый калий - 9,078 г на литр дистиллированной воды, двузамещенный фосфорнокислый натрий - 11,876 г на литр дистиллированной воды.

Маточные растворы можно хранить при температуре 2-4°С в течение 30 дней. Из маточных растворов готовят рабочий буферный раствор из расчета:

79 мл маточного раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия ;

21 мл маточного раствора однозамещенного фосфорнокислого калия ;

900 мл дистиллированной воды.

На потенциометре определяют рН буфера. Он должен быть в пределах 7,2-7,4. При отклонении рН в кислую сторону добавляют раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия, при отклонении рН в щелочную сторону добавляют раствор однозамещенного фосфорнокислого калия.

Рабочий буферный раствор стерилизуют при температуре 120°С в течение 30 минут.

Взятие крови и получение сыворотки

Каждая лаборатория для получения сыворотки крови с целью изготовления питательных сред должна содержать животных-доноров: 10-15 кроликов породы шиншилла или 2-3 барана.

Животные должны получать полноценный сбалансированный рацион, включающий достаточное количество витаминов и минеральных солей.

Кровь берут у кроликов из сердца в количестве 30-40 мл в 100-200-миллилитровые стерильные цилиндры или шприцем, из которого кровь переливают в стерильные пробирки.

Кровь у барана берут из яремной вены в 0,5-1,0-литровые стерильные цилиндры в количестве 400-500 мл.

Цилиндры или пробирки с кровью выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30-40 минут, затем кровяной сгусток обводят металлической спицей и ставят в холодильник для отстаивания сыворотки на 1-2 суток. Отстоявшуюся сыворотку сливают в 100-200-миллилитровые стерильные флаконы и инактивируют в водяной бане при температуре 56-58°С в течение часа.

Инактивированную сыворотку хранят в холодильнике при температуре 1-5°С и используют по мере необходимости для изготовления питательной среды.

Рецепты питательных сред

Водно-сывороточная среда. Воду дистиллированную, водопроводную, колодезную или речную разливают по пробиркам (по 5 мл) и стерилизуют. После охлаждения добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл свежей кроличьей сыворотки, инактивированной в водяной бане при температуре 56-58°С в течение 30 минут. Среду для проверки на стерильность выдерживают в термостате при температуре 37° в течение 3-5 суток.

Водно-сывороточную среду в ветеринарных лабораториях готовят по модифицированной прописи.

Рабочий раствор фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) в количестве 1,4 л разливают в бутыли с сифоном, стерилизуют в автоклаве при 0,8 ати в течение 30 минут (по С.И. Тарасову).

Фильтр Зейтца с пластиной СФ монтируют на 3-5-литровой бутыли и стерилизуют при 1 ати в течение часа.

В охлажденный буферный раствор добавляют 5-10% инактивированной сыворотки кролика или барана и (при наличии) 0,01% камполона (по Л.С. Новиковой).

Смесь фильтруют через фильтр Зейтца (по С.Я. Любашенко), для чего бутыль со средой устанавливают на 1-1,5 м выше фильтра. Профильтрованную среду расфасовывают сифоном в стерильные пробирки или флаконы.

Среду для проверки на стерильность выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 3-5 суток.

Среда Ферворта - Вольфа в модификации С.И. Тарасова

Дистиллированной воды 900 мл, хлористого натрия 0,5 г, пептона (Дифко или Витте) 1 г, маточного раствора фосфатного буфера с рН 7,2 100 мл. Смесь в колбе автоклавируют при 1 ати в течение 30 минут. На следующий день дважды фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и снова автоклавируют при 1 ати в течение 30 минут. В пробирки с прозрачной средой добавляют по 0,5 мл кроличьей сыворотки. Среду прогревают в водяной бане при температуре 56-58°С в течение 30 минут.

Для проверки на стерильность пробирки со средой выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 3-5 суток.

Полужидкая среда Флетчера

К 1 л дистиллированной воды добавляют 2 г агар-агара (лучше агар Дифко). Смесь кипятят 30 минут, расфасовывают по 5 мл в пробирки, автоклавируют при 0,8 ати в течение 30 минут, охлаждают, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл стерильной кроличьей или овечьей сыворотки, прогревают в водяной бане при температуре 56-58°С в течение 30 минут. Среду контролируют на стерильность выдержкой в термостате при температуре 37°С в течение 3-5 суток.

Каждая из приведенных сред обеспечивает выделение культур лептоспир из исследуемого материала и поддержание диагностических штаммов лептоспир.