Вы можете открыть актуальную версию документа прямо сейчас.
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.
ПРИЛОЖЕНИЕ 8
Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с цистеиновой пробой для диагностики сальмонеллезов человека, выявления и дифференциации различных форм бактерионосительства
1. Общие положения
При серологической диагностике сальмонеллезов большое диагностическое значение имеют иммуноглобулины, образование которых обусловливает нарастание титра антител в крови лиц, инфицированных сальмонеллами в определенные периоды жизни. При этом наиболее специфичны в диагностическом плане IgG-антитела. Вместе с тем IgM-антитела появляются в крови раньше других. Они могут образовываться и у здоровых лиц в результате "бытовой" иммунизации или вследствие ранее перенесенной инфекции, т.е. IgM-антитела менее специфичны.
IgM-антитела инактивируются при обработке сыворотки крови цистеином, тогда как IgG-антитела резистентны к этому препарату. После обработки сыворотки крови цистеином в РПГА выявляются только IgG-антитела, тем самым повышается специфичность реакции.
Скорость образования антител и их титр зависят от возраста больного, стадии и тяжести течения болезни, состояния преморбидного фона и других факторов, отражаемых в анализе.
2. Порядок исследования крови человека
2.1. Сыворотку крови взрослых людей исследуют дважды: сразу после поступления больного в стационар и на второй неделе болезни, а при возможности исследование проводят и в период реконвалесценции.
2.2. Сыворотку крови детей первых двух лет жизни исследуют в динамике сразу после поступления ребенка в стационар, затем каждые 7-10 дней. При невозможности проведения повторных исследований однократное серологическое обследование назначают в следующие сроки в зависимости от возраста ребенка:
до года при легкой и среднетяжелой формах - на третьей неделе болезни, при тяжелой форме - на четвертой - шестой;
в возрасте одного - трех лет - на второй неделе независимо от тяжести болезни;
старше трех лет независимо от тяжести болезни - на шестой - седьмой день.
Исследование проводят, как указано в п. 3.1.
В таблице приведен уровень антител в крови детей.
3. Постановка РПГА
3.1. Сыворотку крови исследуют в РПГА с комплексным антигеном без цистеина. При высоком (не ниже 1:320) титре или нарастании уровня антител (и отрицательном результате бактериологического исследования) сыворотку исследуют в РПГА с цистеином со всеми групповыми O-диагностикумами. При этом следует учитывать, что в случае хронического носительства титры суммарных антител могут быть и более низкими. В этом случае при положительном результате бактериологического исследования необходимо ставить РПГА с цистеином.
3.2. Определение антител в РПГА без цистеина
3.2.1. Для постановки реакции исследуемую сыворотку крови разводят 0,85%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:10.
3.2.2. Для титрования готовят раствор 0,85%-ного натрия хлорида на фосфатном буфере (рН 7,0 - 7,2).
3.2.3. В реакции используют коммерческие эритроцитарные сальмонеллезные O-диагностикумы основных серологических групп (A, B, ,
, D и E) и комплексный (поливалентный) O-диагностикум.
3.2.4. Во все лунки полистироловой пластины разливают по 0,5 мл раствора для титрования.
В первую лунку ряда вносят 0,5 мл исследуемой (разведенной) сыворотки. Содержимое лунки тщательно перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, затем после перемешивания - в третью и т.д. до последней лунки ряда.
В каждую лунку ряда вносят 0,1 мл 1%-ной взвеси диагностикума, затем пластину встряхивают для перемешивания компонентов и помещают в термостат на 3 ч или оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч.
Уровень антител в крови детей
Возраст ребенка |
Суммарные O-антитела |
Цистеиноустойчивые O-антитела |
||||
титр на первой неделе болезни |
максимальный уровень |
титр на первой неделе болезни |
максимальный уровень |
|||
сроки появления, неделя |
титр |
сроки появления, неделя |
титр |
|||
До 3 мес. |
1:20 - 1:40 |
4-5-я |
Не более 1:320 |
Отсутствуют |
4-5-я |
1:20 - 1:40 |
3-6 мес. |
1:20 - 1:80 |
4-5-я |
До 1:320 |
1:20 у 10% детей |
4-5-я |
1:20 - 1:80 |
6-12 мес. |
1:20 - 1:160 |
4-5-я |
1:320 и выше |
1:20 у 30-40% детей |
5-я |
До 1:160 |
Старше 1 года |
1:80 - 1:320 |
3-4-я |
1:320 и выше |
1:80 - 1:320 |
3-4-я |
1:320 и выше |
Старше 8 лет |
1:80 - 1:320 |
2-3-я |
1:320 и выше |
1:80 - 1:320 |
2-3-я |
1:320 и выше |
3.3. Определение антител в РПГА с цистеином
3.3.1. Для определения в сыворотке крови удельного содержания IgG-антител готовят раствор цистеина. Для этого 10-15 мг солянокислого L-цистеина (производства Венгрии) или "свободного" цистеина квалификации "ч" растворяют в 1 мл 0,1 н раствора едкого натра с таким расчетом, чтобы pH готового раствора равнялся 7,0-7,2. Готовый р
Если вы являетесь пользователем интернет-версии системы ГАРАНТ, вы можете открыть этот документ прямо сейчас или запросить по Горячей линии в системе.