Приложение 8. Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с цистеиновой пробой для диагностики сальмонеллезов человека, выявления и дифференциации различных форм бактерионосительства

ПРИЛОЖЕНИЕ 8

Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с цистеиновой пробой для диагностики сальмонеллезов человека, выявления и дифференциации различных форм бактерионосительства

1. Общие положения

При серологической диагностике сальмонеллезов большое диагностическое значение имеют иммуноглобулины, образование которых обусловливает нарастание титра антител в крови лиц, инфицированных сальмонеллами в определенные периоды жизни. При этом наиболее специфичны в диагностическом плане IgG-антитела. Вместе с тем IgM-антитела появляются в крови раньше других. Они могут образовываться и у здоровых лиц в результате "бытовой" иммунизации или вследствие ранее перенесенной инфекции, т.е. IgM-антитела менее специфичны.

IgM-антитела инактивируются при обработке сыворотки крови цистеином, тогда как IgG-антитела резистентны к этому препарату. После обработки сыворотки крови цистеином в РПГА выявляются только IgG-антитела, тем самым повышается специфичность реакции.

Скорость образования антител и их титр зависят от возраста больного, стадии и тяжести течения болезни, состояния преморбидного фона и других факторов, отражаемых в анализе.

2. Порядок исследования крови человека

2.1. Сыворотку крови взрослых людей исследуют дважды: сразу после поступления больного в стационар и на второй неделе болезни, а при возможности исследование проводят и в период реконвалесценции.

2.2. Сыворотку крови детей первых двух лет жизни исследуют в динамике сразу после поступления ребенка в стационар, затем каждые 7-10 дней. При невозможности проведения повторных исследований однократное серологическое обследование назначают в следующие сроки в зависимости от возраста ребенка:

до года при легкой и среднетяжелой формах - на третьей неделе болезни, при тяжелой форме - на четвертой - шестой;

в возрасте одного - трех лет - на второй неделе независимо от тяжести болезни;

старше трех лет независимо от тяжести болезни - на шестой - седьмой день.

Исследование проводят, как указано в п. 3.1.

В таблице приведен уровень антител в крови детей.

3. Постановка РПГА

3.1. Сыворотку крови исследуют в РПГА с комплексным антигеном без цистеина. При высоком (не ниже 1:320) титре или нарастании уровня антител (и отрицательном результате бактериологического исследования) сыворотку исследуют в РПГА с цистеином со всеми групповыми O-диагностикумами. При этом следует учитывать, что в случае хронического носительства титры суммарных антител могут быть и более низкими. В этом случае при положительном результате бактериологического исследования необходимо ставить РПГА с цистеином.

3.2. Определение антител в РПГА без цистеина

3.2.1. Для постановки реакции исследуемую сыворотку крови разводят 0,85%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:10.

3.2.2. Для титрования готовят раствор 0,85%-ного натрия хлорида на фосфатном буфере (рН 7,0 - 7,2).

3.2.3. В реакции используют коммерческие эритроцитарные сальмонеллезные O-диагностикумы основных серологических групп (A, B, , , D и E) и комплексный (поливалентный) O-диагностикум.

3.2.4. Во все лунки полистироловой пластины разливают по 0,5 мл раствора для титрования.

В первую лунку ряда вносят 0,5 мл исследуемой (разведенной) сыворотки. Содержимое лунки тщательно перемешивают и 0,5 мл смеси переносят во вторую лунку, затем после перемешивания - в третью и т.д. до последней лунки ряда.

В каждую лунку ряда вносят 0,1 мл 1%-ной взвеси диагностикума, затем пластину встряхивают для перемешивания компонентов и помещают в термостат на 3 ч или оставляют при комнатной температуре на 18-20 ч.

Уровень антител в крови детей

Возраст ребенка	Суммарные O-антитела			Цистеиноустойчивые O-антитела
	титр на первой неделе болезни	максимальный уровень		титр на первой неделе болезни	максимальный уровень
		сроки появления, неделя	титр		сроки появления, неделя	титр
До 3 мес.	1:20 - 1:40	4-5-я	Не более 1:320	Отсутствуют	4-5-я	1:20 - 1:40
3-6 мес.	1:20 - 1:80	4-5-я	До 1:320	1:20 у 10% детей	4-5-я	1:20 - 1:80
6-12 мес.	1:20 - 1:160	4-5-я	1:320 и выше	1:20 у 30-40% детей	5-я	До 1:160
Старше 1 года	1:80 - 1:320	3-4-я	1:320 и выше	1:80 - 1:320	3-4-я	1:320 и выше
Старше 8 лет	1:80 - 1:320	2-3-я	1:320 и выше	1:80 - 1:320	2-3-я	1:320 и выше

3.3. Определение антител в РПГА с цистеином

3.3.1. Для определения в сыворотке крови удельного содержания IgG-антител готовят раствор цистеина. Для этого 10-15 мг солянокислого L-цистеина (производства Венгрии) или "свободного" цистеина квалификации "ч" растворяют в 1 мл 0,1 н раствора едкого натра с таким расчетом, чтобы pH готового раствора равнялся 7,0-7,2. Готовый раствор хранят не более 1 ч.

3.3.2. Исследуемую сыворотку разводят 0,85%-ным раствором натрия хлорида в соотношении 1:5 и смешивают с равным объемом раствора цистеина. Пробирку герметизируют (резиновой пробкой, лейкопластырем, парафином) и помещают в термостат на 18 - 20 ч при температуре 37°С.

Дальнейшее исследование проводят, как указано в п. 3.2.4, при этом в раствор для титрования добавляют 1% нормальной инактивированной сыворотки крови (лошадиной, кроличьей, крупного рогатого скота). Сыворотка должна быть проверена на отсутствие антител к применяемым диагностикумам.

4. Учет РПГА и интерпретация результатов

4.1. Реакция агглютинации считается положительной, если эритроциты полностью агглютинировались и расположены равномерно по дну лунки или при почти полной агглютинации небольшая часть эритроцитов оседает в центре лунки в виде ровного колечка или пуговки. Иногда при положительной реакции края агглютината в лунках могут слегка сползать, и он принимает вид "зонтика". При отрицательном результате агглютината нет, эритроциты оседают на дне в центре в виде пуговки или ровного колечка.

4.2. В случаях выявления нескольких возбудителей с неясной этиологией отсутствие нарастания титра антител (особенно IgG) позволяет предположить транзиторный характер выделения сальмонелл.

4.3. В случае возникновения вспышки сальмонеллеза серологически обследуют максимальное число лиц, подвергшихся риску заражения или подозреваемых в передаче возбудителя.

При этом обнаружение (обычно в низких титрах) антител в РПГА без цистеина и отсутствие последних при исследовании сыворотки в РПГА с цистеином характеризует транзиторное сальмонеллоносительство.

Достаточно высокий титр в РПГА с цистеином показывает хроническое сальмонеллоносительство или переболевание сальмонеллезом (даже субклинически) в течение последних 1-2 мес.

4.4. В случае контроля за бактерионосительством стабильное снижение титра антител (особенно IgG), подтверждаемое отрицательными бактериологическими исследованиями, позволяет сделать заключение об освобождении организма от возбудителя.