Приложение 3. Рецепты консервантов, стабилизаторов и питательных сред

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Рецепты консервантов, стабилизаторов и питательных сред

1. Консерванты и стабилизаторы

1.1. Глицериновый

Состав:
Натрия хлорид (NaCl), 0,85%-ный раствор	1000 мл
Глицерин нейтральный	500 мл
Натрия гидрофосфат безводный 20%-ный раствор	150 мл

Приготовление. Смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор натрия гидрофосфата в таком количестве, чтобы довести pH до 7,8-8,0, затем разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве 15 мин при температуре 112°С или текучим паром три дня подряд. После стерилизации pH 7,6-7,8.

1.2. Фосфатно-буферный

Состав:
Калия дигидрофосфат	0,45 г
Натрия гидрофосфат безводный	5,34 г
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Ингредиенты смешивают, разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве 30 мин при температуре 121°С.

1.3. Буферный глицерино-солевой

Состав:
Натрия хлорид	4,2 г
Калия гидрофосфат	3,1 г
Калия дигидрофосфат	1,0 г
Глицерин нейтральный	300 мл
Вода дистиллированная	700 мл

Приготовление. Ингредиенты растворяют, перемешивают, смесь разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют 30 мин при температуре 112°С. Рекомендуется с целью контроля в процессе хранения раствор слабо подкрашивать феноловым красным.

2. Среды обогащения*(1)

Предварительную среду обогащения готовят, как указано в п. 1.2, но вместо дистиллированной воды используют пептонную.

2.1. Селенитовая среда

Состав:
Натрия гидроселенит без примеси теллура	4 г
Пептон	5 г
Натрия гидрофосфат безводный	7 г
Натрия дигидрофосфат безводный	3 г
Лактоза	4 г
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Среду готовят из двух основных растворов.

Раствор 1. Определяют пропорцию натрия гидрофосфата и натрия дигидрофосфата с используемым образцом пептона и натрия гидроселенита для установления pH 6,9-7,1. С этой целью регулируют соотношение фосфатов. Подтитровка нужна всегда при изменении серии любого из входящих в среду основных ингредиентов. После установления соотношения фосфатов к раствору добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром по 30 мин два дня. Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные препараты. При отсутствии таковых заранее заготовленные навески "выветривают" 15-16 сут. в термостате.

Раствор 2. 10%-ный раствор натрия гидроселенита готовят на стерильной дистиллированной воде перед употреблением.

Перед началом работы во флакон с 50 мл раствора 1 добавляют 2 мл раствора 2, разливают по 5-7 мл в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не требуется.

Основной раствор (первый) для среды можно хранить в холодильнике 1-2 мес. При приготовлении среды следует использовать высококачественный пептон (желательно "Рихтер", "Спофа" или жидкий аминопептид - отечественный заменитель импортного пептона).

2.2. Селенитовый бульон с аминопептидом

Состав:
Бульон аминопептидный	960 мл
Натрия гидрофосфат	8 г
Натрия дигидрофосфат	2 г
Натрия гидроселенит, 10%-ный водный раствор	40 мл
Бульон аминопептидный
Состав:
Аминопептид	250 мл
Натрия хлорид (NaCl)	5,5 г
Вода дистиллированная	750 мл

Приготовление. Среду хорошо перемешивают, стерилизуют 20 мин при 121°С. Готовый бульон можно хранить в бутылях неопределенный срок, желательно при 6-10°С.

К бульону непосредственно перед употреблением добавляют 40 мл стерильного 10%-ного водного раствора натрия гидроселенита (рН при этом снижается на 0,1-0,2), среду тщательно перемешивают и разливают в стерильные пробирки по 5 мл с соблюдением правил асептики.

Примечание. Фосфаты натрия могут быть заменены фосфатами калия в тех же количествах.

2.3. Магниевая среда

Среда состоит из трех растворов.

Раствор 1
Пептон	4,2 г
Натрия хлорид	7,15 г
Калия дигидрофосфат	1,48 г
Дрожжевой диализат	9 мл
Вода дистиллированная	890 мл
Раствор 2
Магния хлорид	35,7 г
Вода дистиллированная	90 мл
Раствор 3
Бриллиантовый зеленый, 0,5%-ный водный раствор	0,9 мл

Приготовление. Все три раствора смешивают в указанных количествах, разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки, стерилизуют при 112°С 30 мин.

2.4. Среда Мюллера (тетратионатовый бульон Мюллера)

Состав:
Мел, стерилизованный сухим жаром	45 г
или
Кальция карбонат сухой стерильный	25 г
Бульон Хоттингера, содержащий 120-130 мг % аминного азота	900 мл
Раствор Люголя (калия йодид (KI) - 20 г, йод кристаллический - 25 г, вода дистиллированная - 1000 мл)	20 мл
Натрия тиосульфат *(2), 50%-ный стерильный раствор (к 50 г натрия тиосульфата добавляют воду до 100 мл, растворяют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 мин)	100 мл

Приготовление. В стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют 30 мин при температуре 121°С (рН 7,2-7,4). В каждый флакон ex tempore добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора натрия тиосульфата с соблюдением правил асептики, хорошо смешивают и разливают по пробиркам. Дальнейшая стерилизация не требуется.

2.5. Среда Кауфмана

Состав:
Среда Мюллера (стерильная)	500 мл
Желчь бычья (стерильная)	250 мл
Бриллиантовый зеленый, 0,1%-ный водный раствор	50 мл

Приготовление. Ингредиенты смешивают, асептически разливают в стерильные пробирки по 10 мл, дополнительно не стерилизуют.

2.6. Бульон желчный 20%-ный

Состав:
Бульон мясопептонный или Хоттингера	800 мл
Желчь бычья нативная	200 мл

Приготовление. pH должен быть 7,6. Смесь разливают по 50 мл во флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром по 30 мин три дня.

3. Дифференциально-диагностические среды для первичных посевов материала и высевов со сред обогащения

По степени подавления роста посторонней микрофлоры среды подразделяют на высокоселективные (висмут-сульфитный агар), среднеселективные (среда Плоскирева, слабощелочной питательный агар) и низкоселективные (среды Эндо, Левина).

3.1. Учет роста на дифференциально-диагностических средах. На висмут-сульфитном агаре почти все сальмонеллы растут в виде черных колоний с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляет S. choleraesuis (группа C), которая при росте на этой среде образует светлые нежные зеленоватые колонии. Просмотр чашек с висмут-сульфитным агаром проводят через 24 и 48 ч после посева.

На средах Плоскирева, Эндо, Левина сальмонеллы образуют мелкие (1-2 мм в диаметре), слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью влажные колонии. На среде Плоскирева колонии бесцветные, мутноватые, уплотненные; Эндо - обычно прозрачные, слегка розоватые; Левина - прозрачные с легким фиолетовым оттенком; на слабощелочном питательном агаре (СПА) - нежные, прозрачные, голубоватые.

4. Среды для первичной идентификации

4.1. Агар Клиглера

Коммерческую сухую среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке. Готовая к употреблению среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет. При скашивании следует оставлять столбик высотой 2-2,5 см.

4.2. Комбинированная среда по Олькеницкому

Состав:
Агар питательный сухой	25 г
Лактоза	10 г
Аммоний-железо (II) сульфат	0,2 г
Натрия тиосульфат	0,3 г
Мочевина	10 г
Феноловый красный, 0,4%-ный водный раствор	4 мл
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2-7,4, добавляют индикатор и разливают в пробирки по 6-7 мл. Среду стерилизуют текучим паром по 20 мин три дня и скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

4.3. Учет биохимических свойств сальмонелл на указанных средах проводят визуально. Появление желтой окраски в скошенной части агара характеризует ферментацию лактозы (и сахарозы в среде Олькеницкого), в столбике - глюкозы.

Газообразование устанавливают по появлению пузырьков, разрывам агара или его отслоению от стенок пробирки.

Об образовании сероводорода судят по почернению среды, обычно в середине столбика.

При росте культуры, гидролизующей мочевину, среда Олькеницкого приобретает красно-малиновый цвет.

При росте культур, образующих большое количество сероводорода или гидролизующих мочевину, учет ферментации углеводов в большинстве случаев невозможен.

4.4. Приготовление среды Ресселя (сухой) описано на этикетке. Учет роста сальмонелл указан в п. 4.3.

5. Среды для биохимической дифференциации

5.1. Цитратный агар Симонса

Коммерческую сухую среду готовят согласно указаниям на этикетке препарата. Среду разливают в пробирки по 5-7 мл, при скашивании после стерилизации которых оставляют столбик 2-2,5 см.

Бактерии, усваивающие цитрат, окрашивают среду в синий цвет.

5.2. Агар с фенилаланином

Состав:
Дрожжевой экстракт сухой	3 г
или
Экстракт жидкий	100 мл
Натрия хлорид	5 г
Натрия гидрофосфат	1 г
L-фенилаланин	2 г
или
DL-фенилаланин
Агар-агар	12 г
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Дрожжевой экстракт вносят в холодную воду, нагревают, затем последовательно добавляют остальные ингредиенты и кипятят до полного расплавления агара (5-10 мин), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают по 2-3 мл в пробирки. pH среды должен быть 7,0-7,2. Стерилизуют 30 мин при температуре 112°С и охлаждают в скошенном положении. Готовая среда не окрашена.

На выросшую культуру по скошенной части агара вносят 4-5 капель реактива (10%-ного водного раствора железа (III) хлорида - , хранящегося при 4-6°С без доступа света). При наличии в культуре фенилаланиндезаминазы образуется дорожка зеленого цвета.

5.3. Среда с мочевиной по Кристенсену

Состав:
Пептон	1 г
Натрия хлорид	5 г
Калия дигидрофосфат	2 г
Агар-агар	20 г
Глюкоза	1 г
Феноловый красный, 0,2%-ный раствор	6 мл
Мочевина, 20%-ный раствор	100 мл
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Пептон, соли и агар растворяют при нагревании, фильтруют и стерилизуют 20 мин при температуре 115°С. Затем добавляют глюкозу и индикатор, стерилизуют текучим паром 1 ч, охлаждают до 50-55°С, после чего вносят раствор мочевины, профильтрованный через фильтр Зейтца*(3). Готовую среду разливают в стерильные пробирки с соблюдением правил асептики и охлаждают в скошенном положении.

При выделении культурой уреазы, среда приобретает малиновый цвет.

5.4. Среда с мочевиной по Преусу

Состав:
Бульон Хоттингера	1000 мл
Агар-агар	15 г
Глюкоза	5 г
Мочевина, 50%-ный водный раствор	20 мл
Бромтимоловый синий, 0,2%-ный водный раствор	12 мл

Приготовление. Агар расплавляют в бульоне при подогревании, фильтруют, устанавливают pH 6,9-7,0. Стерилизуют 20 мин при температуре 121°С. К стерильному питательному агару добавляют глюкозу, мочевину, индикатор. Стерилизуют текучим паром 15 мин, после чего скашивают. Цвет готовой среды оливковый. В случае гидролиза мочевины среда приобретает синий цвет.

5.5. Среда Кларка

Состав:
Пептон	5 г
Калия гидрофосфат	5 г
Глюкоза	5 г
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Ингредиенты растворяют в воде, кипятят 2-3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 6,9-7,0, разливают в пробирки. Стерилизуют 20 мин при температуре 112°С или по 20 мин три дня текучим паром.

Среду Кларка применяют для постановки реакций с метиловым красным (метилротом) и Фогес-Проскауэра.

Реакция с метиловым красным

Состав реактива:
Метиловый красный	0,1 г
Спирт этиловый 96°-ный	300 мл
Вода дистиллированная	200 мл

Приготовление. Краску растворяют в спирте, затем добавляют воду до 500 мл.

Для постановки реакции к четырехсуточной культуре добавляют 3-5 капель реактива. В случае образования кислоты при ферментации глюкозы среда окрашивается в красный цвет. При слабом кислотообразовании цвет среды желтый.

Реакция Фогес-Проскауэра

Состав реактивов:
6%-ный раствор L-нафтола	30 г
Спирт этиловый 96°-ный	500 мл
Калия гидроокись (KOH)	120 г
Вода дистиллированная	300 мл

Реактивы смешивают перед применением.

К четырехсуточной культуре добавляют равный объем смеси реактивов. Через 4-6 ч инкубирования в термостате учитывают цвет среды. В положительном случае среда приобретает розовый цвет с желтым оттенком.

5.6. Среды с углеводами*(4)

Состав:
Пептон	10 г
Натрия хлорид	5 г
Индикатор Андреде	10 мл
Углевод	5 или 10 г
Вода дистиллированная	1000 мл

В качестве индикатора pH могут быть использованы растворы бромтимолового синего, фенолового красного или бромкрезолового пурпурного. Для специальных целей среду с лактозой готовят с большим содержанием сахара (2-10%). К средам может быть добавлен агар (0,2-0,4%).

Приготовление. Пептон растворяют в воде при подогревании, добавляют натрия хлорид и индикатор, фильтруют, устанавливают pH 7,1-7,2, стерилизуют 15 мин при температуре 121°С. К стерильной основе добавляют соответствующий углевод: 1% лактозы, глюкозы, маннита или сахарозы или 0,5% рамнозы, ксилозы, мальтозы, арабинозы, салицина, трегалозы, рафинозы, целлобиозы, дульцита, сорбита, адонита или глицерина. Среду разливают в стерильные пробирки по 3-4 мл, в пробирки с глюкозой помещают поплавки (перевернутые бродильные пробирки Дюрхема). Стерилизуют 30 мин при температуре 110°С или дробно текучим паром по 30 мин два дня. Готовая среда должна быть соломенно-желтого цвета без розового оттенка.

При образовании кислоты цвет среды меняется от бледно-розового до красного.

В коммерческие среды добавляют индикатор бромкрезоловый пурпуровый. В этом случае цвет готовой среды - фиолетовый, при образовании кислоты меняется до желтого или желто-коричневого.

5.7. Среды для определения индолообразования. Культуру высевают на одну из следующих сред: бульон на триптическом переваре казеина (1,2-1,4% аминного азота); бульон на триптическом переваре Хоттингера (1,2-1,4% аминного азота); 2%-ная пептонная вода; 1%-ная пептонная вода с добавлением 0,3% L-триптофана; полужидкий агар, приготовленный на бульоне Хоттингера. Через 24 и 48 ч инкубирования ставят реакцию с реактивом Эрлиха.

К бульонной культуре приливают 2-3 мл эфира. Содержимое перемешивают, дают эфиру отстояться и добавляют несколько капель реактива следующего состава: парадиметиламидобензальдегида 1 г, крепкой хлористоводородной кислоты 20 мл, 96-градусного спирта 95 мл.

В присутствии индола эфир окрашивается в розовый или красный цвет.

5.8. Среды с аминокислотами - лизином, оринтином и аргинином

Состав:
Вода дистиллированная	1000 мл
Пептон	5 г
Дрожжевой экстракт	8 г
или
Аутолизат дрожжей	12-15 мл
Глюкоза	1 г
Бромкрезоловый пурпурный, 1,6%-ный спиртовой раствор	0,6 мл
Крезоловый красный, 0,1%-ный спиртовой раствор	5 мл
L-аминокислота	10 г
или
DL-аминокислота	20 г

Указанный в прописи индикатор может быть заменен на бромтимоловый синий (1 мл 1,6%-ного спиртового раствора).

Вместо дрожжевого экстракта или аутолизата дрожжей можно брать 400 мл мясной воды, соответственно уменьшив объем дистиллированной воды до 600 мл.

Приготовление. В воде растворяют белковую питательную основу и глюкозу. Устанавливают pH 6,0-6,1. Затем среду делят на равные части. В каждую из трех порций вносят одну из аминокислот (лизин, орнитин или аргинин) в количестве, зависящем от кристаллизационной формы реактива (L или DL). В последнюю порцию питательной основы аминокислот не добавляют, оставляя ее в качестве контрольной. Среды кипятят 5-10 мин и вновь устанавливают pH 6,0-6,1. Во все порции вносят раствор индикатора, перемешивают, разливают в пробирки по 2-3 мл. Стерилизуют 30 мин при температуре 110°С. Цвет среды от желтого до оливкового, который при расщеплении аминокислот изменяется в зависимости от применяемого индикатора.

5.9. Глицерино-фуксиновый бульон Штерна

Состав:
Бульон Хоттингера стерильный, pH 8,0	1000 мл
Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор	2,5 мл
Натрия сульфит , 10%-ный водный раствор	16,6 мл
Глицерин нейтральный	10 мл

Приготовление. К бульону добавляют раствор фуксина, свежеприготовленный раствор сульфита натрия и глицерин, хорошо смешивают, разливают в пробирки по 6-7 мл, стерилизуют 15 мин при температуре 112°С. Хранят среду в холодильнике не более 14 дней.

5.10. Полужидкий агар для определения подвижности

Состав:
Натрия хлорид	5 г
Гидролизат Хоттингера	120-150 мл
Агар-агар	3-4 г
Вода дистиллированная	1000 мл

Приготовление. Перевар Хоттингера разводят водой до содержания в среде 1,2-1,4% аминного азота, добавляют хлорид натрия, устанавливают pH 7,2-7,4, вносят агар и полностью расплавляют его, подогревая среду при постоянном помешивании. Затем фильтруют в горячем состоянии через тканевый фильтр, проверяют прозрачность (визуально) и в случае необходимости осветляют с помощью яичного белка или путем отстаивания в узких сосудах. Среду стерилизуют в пробирках 30 мин при 121°С. Охлаждают в вертикальном положении.

Примечание. Среда может быть одновременно использована для определения индолообразования.

______________________________

*(1) Для получения сред обогащения двойной концентрации (при исследовании жидких материалов) соответственно уменьшают вдвое объем дистиллированной воды.

*(2) Натрия тиосульфат часто неправильно именуют гипосульфитом.

*(3) Возможно использование 50%-ного водного раствора мочевины, выдержанного 2-3 сут. для самостерилизации и добавленного к среде из расчета конечного содержания мочевины в среде 2%.

*(4) Выпускаются коммерческие сухие среды с углеводами (глюкозой, лактозой, мальтозой, сахарозой и маннитом). Их приготовление указано на этикетке.