Приложение N 1. Вибриоз рыб (справка)

Приложение N 1
к Временной инструкции по
борьбе с вибриозом рыб
от 26 мая 1998 г.

Вибриоз рыб (справка)

1. Возбудитель вибриоза рыб - бактерии Vibrio anguillarum представляют собой короткие, тонкие (1,6-2,5х0,4-1,0 мкм), слабоизогнутые грамотрицательные палочки не образующие спор и капсул. Активную подвижность бактерий обеспечивает один полярно расположенный жгутик. Бактерии являются факультативными анаэробами. Они продуцируют протеолитические ферменты и токсины.

Бактерии Vibrio anguillarum выделяют из воды, ила и от гидробионтов. Возбудитель болезни попадает в организм рыбы через жабры, оральным и анальным путями.

2. При подозрении на вибриоз обращают внимание на частоту и время вспышек болезни со сходной клинической картиной, температуру воды и её соленость, динамику заболевания и отход рыбы:

а) рыбы заболевают вибриозом преимущественно в летние месяцы при нагревании воды до температуры выше 16°С. Заболевание достигает максимума при температуре 19-20°С.

б) максимальный отход рыбы регистрируется при солености воды 6,5-8,5%.

в) наибольшие потери (гибель) регистрируют среди годовиков и сеголетков в первый месяц с момента заболевания, особенно при высокой плотности посадки.

3. Из клинических признаков при остром течении болезни у рыб в первую очередь регистрируют отказ от корма и снижение двигательной активности. У части рыб наблюдается орошение чешуи, покраснение кожных покровов у основания плавников, анального отверстия и в других частях брюшной стенки, а также геморрагии, некротические изменения и изъязвления в коже и мышцах. У части рыб болезнь протекает бессимптомно, но со значительным отходом, особенно среди годовиков и двухлетков. При бактериологическом исследовании возбудитель болезни легко высевается из крови.

При хроническом течении болезни (свыше 7-8 недель) характерным признаком является наличие в мышцах рыб абсцессов и длительно незаживающих язв. Возбудитель болезни редко высевается из крови, но высевается из внутренних органов.

4. Патолого-анатомические изменения характеризуются выраженной гиперемией и геморрагиями тканей внутренних органов при увеличении их размеров, наличием интрамускулярных абсцессов, некрозов и язв, а в брюшной полости - асцитной жидкости. Желудок и кишечник пустые, гиперемированные. Анус выпяченный и отечный. Кожа на разрезе в месте припухлостей темно-красного цвета, мышечная ткань дряблая.

5. При бактериологическом исследовании на вибриоз патологический материал отбирают только от живых рыб:

5.1. Для исследования берут пробы крови из сердца и содержимого брюшной полости, материал из полости абсцессов и стенок язв, сердце, печень, селезенку и почки.

5.2. Место отбора материала прижигают шпателем, после чего стерильной пастеровской пипеткой отбирают пробу материала и переносят ее в одну пробирку с 6 мясо-пептонного бульона (МПБ - см. приложение N 2, п. 1.1.) или пептонной воды, содержащих 1,5% хлорида натрия. После 2-3 пипеттирований посевной материал в объеме 0,5-1,0 засевают в две пробирки на скошенный мясо-пептонный агар (МПА - см. приложение N 2, п. 1.2.) с 1,5% хлористого натрия и в две пробирки на скошенный дифференциально-диагностический агар (ДДА - см. приложение N 2, п. 1.3.). Посевы инкубируют при температуре 20-22°С. Учет проводят каждый день в течение 7 суток. Полученные культуры подвергают бактериоскопии. Затем определяют их подвижность и галофильность, оценивают рост колоний при посеве на обычные и дифференциальные среды и ставят с ними биопробу.

5.3. Бактериоскопия. На чистое обезжиренное стекло наносят стандартной бактериологической петлей (диаметр 2 мм) каплю физиологического раствора, тщательно суспендируют в ней небольшое количество исследуемой культуры и равномерно распределяют суспензию по поверхности стекла. Препарат высушивают при комнатной температуре и фиксируют путем проведения 5-6 раз над пламенем горелки. После охлаждения препарат окрашивают по Граму. Вначале - в течение 2 мин карболовым раствором генцианового фиолетового. Смыв краску водой, препарат помещают на 2 мин в раствор Люголя. Затем в течение 30 секунд обрабатывают 96%-ным спиртом. Тщательно отмыв препарат от спирта, окрашивают его в течение 2 мин фуксином Пфейфера.

После промывания водой и просушивания фильтровальной бумагой препарат микроскопируют при увеличении 10х90 под иммерсией. Бактерии, окрасившиеся в синий, цвет считают грамположительными; и красный цвет - грамотрицательными. Вибрионы грамотрицательны.

5.4. Определение подвижности. На обезжиренное предметное стекло наносят бактериологической петлей каплю физиологического раствора, суспендируют в ней небольшое количество испытуемой культуры и накрывают покровным стеклом. Препарат микроскопируют при увеличении 10х90. Бактерии Vibrio anguillarum активно подвижны.

5.5. Определение галофильности. Исследуемую культуру высевают на МПА без содержания хлористого натрия и на МПА с 1,5-, 3-, 7-, 10% хлористого натрия, скошенный и пробирках. Посевы инкубируют при 20-22°С в течение 48 часов. Оценку результатов теста проводят, исходя из того, что культуры Vibrio anguillarum, кроме типа С, не растут на среде без содержания хлористого натрия, а также, что все они не растут при содержании в среде 7,0% и более хлористого натрия, но хорошо растут при концентрации соли от 0,25 до 5,2%.

5.6. Оценка роста вибрионов на плотных питательных средах. Испытуемые культуры бактерий, сходные по культуральным свойствам и морфологии с вибрионами, суспендируют в стерильном физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы концентрация микробных клеток составила 1 по оптическому стандарту мутности ГИСК. Приготовленные суспензии разводят последовательно десятикратно до и из последних разведений в объеме 0,1 высевают на МПА с 1,5% хлористого натрия и ДДА, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при температуре 20-22°С в течение 48 часов.

На МПА вибрионы растут в виде прозрачных, светлых выпуклых колонии с ровными краями, имеющих в проходящем свете светло-голубоватый оттенок.

По оценке роста колоний на ДДА проводят ориентировочную дифференциацию вибрионов от других микроорганизмов. На данной среде вибрионы формируют колонии желтого цвета, без изменения цвета среды вокруг колоний. Также в виде колоний желтого цвета на ДДА растут некоторые штаммы аэромонад и псевдомонад, но среда вокруг колоний становится синеватой. Колонии V. parachemolyticus на этой среде имеют голубоватый цвет.

Типичные для Vibrio anguillarum колонии отбирают бактериологической петлей и пересевают на МПА с 1,5% хлористого натрия, скошенный в пробирках. Посевы инкубируют при температуре 20-22°С и течение 24-48 часов. Выращенные культуры используют для постановки биопробы и изучения ферментативных свойств бактерий.

5.7. Биопроба. Для определения патогенности односуточную культуру вибрионов суспендируют в физиологическом растворе и вводят 3-5 рыбам аналогичного вида массой 100-200 г внутримышечно и 3-5 рыбам - внутрибрюшинно в дозе 200 млн микробных клеток в объеме 0,2 .

Из пяти рыб аналогов формируют контрольную (без введения культуры) группу и выдерживают ее в отдельном аквариуме. Температура воды в аквариумах должна быть 18-20°С. Срок наблюдения 18 суток.

В случае заболевания или гибели инфицированной рыбы проводят бактериологическое исследование взятого от неё патологического материала, с последующей идентификацией выделенной культуры по результатам серологического исследования с агглютинирующей сывороткой против Vibrio anguillarum, или - результатам изучения ферментативных свойств.

Биологическая проба считается положительной, а диагноз на вибриоз установленным при проявлении не менее чем у 50% рыбы, инфицированной испытуемой культурой, клинических признаков болезни или при ее гибели и выделении от такой рыбы культуры Vibrio anguillarum. Рыбы контрольной группы, при этом, должны оставаться живыми.

6. Изучение ферментативных свойств:

6.1. Определение продукции цитохромоксидазы. а-нафтол в количестве 30-40 мг растворяют в 2,5 96%-ного этилового спирта (ректификованного), затем прибавляют 7,5 дистиллированной воды и 60 диметил-парафенилендиамина. Реактив готовят eх tempore и обрабатывают им полоски фильтровальной бумаги размером 1,5х9 см. Исследуемую культуру наносят штрихом с помощью бактериологической петли на обработанную реактивом полоску бумаги. Если на полоске бумаги в месте нанесения культуры появляется синее окрашивание, культуру оценивают как оксидазоположительную. Если цвет не изменяется - как оксидазоотрицательную. Бактерии Vibrio anguillarum оксидазоположительные.

6.2. Определение продукции сероводорода. Полоску фильтровальной бумаги (1х10 см), обработанную насыщенным водным раствором уксуснокислого свинца и высушенную в термостате, помещают в пробирку со скошенным МПА с 1,5% NaCI непосредственно после засева испытуемой культуры таким образом, чтобы нижний край полоски находился на расстоянии 1 см от питательной среды. Посевы инкубируют при температуре 20-22°С в течение 5 суток. Результаты учитывают ежедневно. Почернение нижней части полоски фильтровальной бумаги оценивают как положительный результат. Бактерии Vibrio anguillarum сероводород не продуцируют.

6.3. Тест окисления ферментации на среде Хью-Лейфсона. Среду, состоящую из 3,0 г агара; 2,0 г пептона; 15,0 г хлорида натрия; 0,3 г двузамещенного фосфатнокислого калия; 3 1% водного раствора бромтимолблау; 1000 дистиллированной воды стерилизуют при 121°С (1 атм) в течение 15 мин. После охлаждения до 45-50°С в среду вносят 25 40%-ного раствора глюкозы и разливают по 3 в пробирки. Исследуемую культуру засевают уколом в две пробирки со средой. Стерильной пипеткой на поверхность среды одной из пробирок наносят 1 стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 22-25°С в течение 4 суток. Видовую принадлежность культуры оценивают, исходя из того, что вибрионы и аэромонады ферментируют глюкозу как в аэробных условиях - пожелтение среды в пробирках без вазелина (0+), так и в анаэробных - пожелтение среды в пробирках под вазелином (F+). При прочих результатах теста культуру считают не принадлежащей к роду Vibrio и Aeromonas.

6.4. Протеолитические свойства. Исследуемую культуру засевают уколом в столбики желатина в 2 пробирки. Посевы инкубируют при температуре 20-22°С в течение 4 суток. Перед учетом результатов пробирки с посевами вместе с контролем (без посева) помещают на 20 мин в холодильник. Если желатин остается твердым, как в контроле, то результат оценивают как отрицательный. При положительном результате желатин разжижается и остается жидким при выдерживании в холодильнике. Бактерии Vibrio anguillarum разжижают желатин.

6.5. Проба на индол. Индол образуется в результате распада аминокислот под действием микроорганизмов. Испытуемую культуру выращивают на бульоне Хоттингера при температуре 20-22°С в течение 4 суток. В пробирку, содержащую 5 бульонной культуры, вносят 6 капель реактива Ковача, который готовят следующим образом: в 150 растворяют 10,0 г парадиметиламинобензоальдегида, после чего к раствору медленно добавляют 50 концентрированной соляной кислоты. При окрашивании содержимого пробирки в розовый цвет результат пробы оценивают положительно. Если окрашивание не наступило - отрицательно. Бактерии Vibrio anguillarum - за исключением биотипов "В" и "С", - считаются индоположительными.

6.6. Декарбоксилазная активность. Декарбоксилазную активность определяют на жидких питательных средах с аминокислотами (лизином, орнитином, аргинином), приготовленными по Меллеру (см. приложение N 2. п. 1.4.).

Каждый исследуемый штамм засевают в 4 пробирки - соответственно с лизином, орнитином, аргинином и без добавления аминокислоты (контроль). В каждую пробирку засевают по одной полной бактериологической петле культуры. Сразу после засева во все пробирки добавляют стерильное вазелиновое масло. Посевы инкубируют при температуре 20-22°С в течение 6 суток. Изменение цвета среды указывает на декарбоксилазную активность изучаемой культуры.

Бактерии Vibrio anguillarum не декарбоксилируют орнитин и лизин, но проявляют аргининдегидролазную активность.

6.7. Уреазную активность бактерий Vibrio anguillarum определяют на средах с мочевиной. Испытуемую культуру засевают петлей на агар Кристенсена (см. приложение N 2, п. 1.5.) и инкубируют при температуре 20-22°С в течение 2-4 суток. Расщепление мочевины определяют по изменению цвета среды от желтого к фиолетово-красному. Бактерии Vibrio anguillarum не обладают уреазной активностью и, таким образом, не разлагают мочевину.

6.8. Ферментация углеводов и многоатомных спиртов. В качестве основы для приготовления сред с углеводами используют 1%-ную пептонную воду (рН 7,2-7,4) с 1,5% хлористого натрия. В воду добавляют (отдельно) по 1% мальтозы, лактозы, глюкозы, сахарозы, маннозы, арабинозы, маннита, инозита и в каждую пробирку по 1% индикатора Андраде. Среды в объеме по 2 см разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при температуре 110-112°С (0,5 атм) в течение 20 мин. Результаты роста культур на средах с углеводами учитывают на 4-е сутки после культивирования при температуре 20-22°С. Об образовании кислоты, при расщеплении углеводов и спиртов судят по покраснению (бесцветных ) сред, а о газообразовании по наличию в поплавках пузырьков газа. Бактерии Vibrio anguillarum расщепляют углеводы, за исключением инозита, до кислоты без образования газа.

Результаты изучения культуральных, морфологических и ферментативных свойств используют для дифференциации бактерий Vibrio anguillarum от других бактерий, вызывающих у рыб заболевания со сходными клиническими признаками (таблица 1).

Таблица 1 Дифференциально-диагностические свойства бактерий Vibrio anguillarum и бактерий, вызывающих у рыб сходные заболевания

Основные признаки	Vibrio anguillarum	Aerоmonas	Pseudomonas	Plesiomonas	Enterobacteriaceae	V.parahaemolyticus	Aeromonassalmonicida
1	2	3	4	5	6	7	8
Подвижность	+	+	+	+		-	+
Оксидаза	+	+	+	+	-	+	+
Образование	-	+		-		-	+
Расщепление глюкозы:
- окисление	+	+	+	-	+	+	+
- ферментация	+	-	-			+	-
Ферментация:
- сахарозы			-	-		-
- маннозы		+	-			+	-
- маннита		+	-			+	-
- инозита	-	-	-	-			-
Рост на среде:
- без NaCl	-/+	+	+	+	+	-	+
- NaCl (10%)	-	-	-	-	-	+	-
Образование декарбоксилозы:
- лизина	-	-	-	+	+	+
- орнитина	-	-	-	+	+	+	0
Образование дегидроксилазы:
- аргинина		+	+	-	+	-	0

Примечания:

+ - реакция положительная;

- - реакция отрицательная;

+/- - реакция чаще положительная;

-/+ - реакция чаще отрицательная;

- признак вариабелен;

к - кислота;

о - данные отсутствуют

Кроме того, полученные результаты используют для подразделения испытуемых культур на биотипы (таблица 2).

Таблица 2 Характеристика биотипов Vibrio anguillarum, выделенных от рыб

Биотип	Маннит	Сахароза	Индол	Рост на среде без NaCI
A			+	-
B	-	-	-	-
C			-	+
D	-		+	-
E	-	-	+	-

Примечания:

+ - реакция положительная;

- - реакция отрицательная;

к - кислота

7. Серологическое типирование вибрионов проводят в соответствии с действующим Наставлением по применению сыворотки агглютинирующей против Vibrio anguillarum.

Диагноз на вибриоз считается установленным при положительном результате серологической идентификации возбудителя и наличии у рыб клинических признаков и патолого-анатомических изменений, характерных для данной болезни.

8. Серологическую диагностику вибриоза рыб проводят путем исследования сыворотки крови рыб в реакции непрямой гемагглютинации (РНТА) на стекле с диагностикумом, принятым в ветеринарной практике.

При получении положительных результатов исследований и наличии у рыб клинических и патолого-анатомических изменений, характерных для данной болезни, а в случае бессимптомного течения при гибели рыбы, диагноз на вибриоз считается установленным.