Приложение

Приложение

1. Способ фиксации мазков в этиловом спирте с добавлением 3% перекиси водорода

При данном способе фиксации мазков споровые и вегетативные формы Вас. anthracis обезвреживаются через 30 мин, при этом не нарушается морфология микроба и специфичность свечения при окраске люминесцирующими сыворотками.

1.1. Для приготовления фиксирующей жидкости во флакон наливают 180 мл этилового 96°-ного спирта и 20 мл 30 %-ного пергидроля. Содержание перекиси водорода в пергидроле при необходимости определяют по методике, изложенной в Государственной фармакопее СССР.

Фиксирующую жидкость можно использовать в течение 1 мес, при этом флакон необходимо закрывать притертой пробкой и хранить в темном месте.

1.2. Мазки готовят на чистых обезжиренных стеклах общепринятыми методами, высушивают на воздухе, затем опускают в посуду с фиксирующей жидкостью. Через 30 мин мазки извлекают и высушивают на воздухе. Выдерживать мазки более 30 мин в фиксирующей жидкости нежелательно. Дальнейшие манипуляции с мазками проводят как с обезвреженным материалом.

2. Дифференциально-диагностическая среда для выделения Вас. anthracis

2.1. Для дифференциации колоний сибиреязвенного микроба от колоний спорообразующих сапрофитов используют тест обнаружения щелочной фосфатазы.

Первичные посевы или посевы подозрительных культур на дифференциально-диагностической среде инкубируют в термостате при 37 1°С в течение 18-24 ч.

При наличии роста микроорганизмов в крышку чашки Петри вносят 1-2 мл 25 %-ного водного раствора аммиака. Чашку (крышкой вниз) выдерживают при 20 2°С в течение 1 мин, после чего визуально или под малым увеличением микроскопа проводят учет теста.

Под действием паров аммиака происходит порозовение колоний микроорганизмов, обладающих фосфатазной активностью, а Вас. anthracis фосфатазной активностью не обладает и его колонии остаются бесцветными.

2.2. Приготовление растворов. Полимиксина М сульфат во флаконе растворяют в стерильной дистиллированной воде, а затем последовательными разведениями стерильным 0,9 %-ным раствором натрия хлорида доводят до концентрации 10 000 ЕД/мл.

Невиграмон переносят в стеклянный флакон или пробирку и растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака при тщательном перемешивании стеклянной палочкой. Затем последовательно разводят стерильным 0,9 %-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл.

Моющее средство "Прогресс" разводят стерильной дистиллированной водой до 0,1 %-ной концентрации.

Гризеофульвин в таблетках тщательно растирают в ступке, затем растворяют в стерильной дистиллированной воде до содержания 100 мкг препарата в 1 мл.

Фенолфталеинфосфат натрия (коммерческий 10%-ный раствор) для стерилизации прогревают на водяной бане при 56 °С в течение 30 мин.

2.3. Приготовление дифференциально-диагностической среды. Питательный агар в колбах вместимостью 100 мл расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до температуры 45-50°С. Затем в агар добавляют основные растворы: полимиксина М сульфата - 0,5 мл; невиграмона - 0,5 мл; гризеофульвина^* - 1 мл; моющего средства "Прогресс" - 1 мл; фенолфталеинфосфата натрия - 0,1 мл.

После перемешивания среду разливают в чашки Петри и подсушивают в течение 1,5-2 ч, оставив крышки чашек открытыми. Дифференциально-диагностическую среду после разлива можно хранить в холодильнике в течение одних-двух суток.

2.4. Готовую дифференциально-диагностическую среду выпускает Ставропольский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (355100, г. Ставрополь, ул. Биологическая, 20).

3. Приготовление системы для постановки реакции диск-преципитации

3.1. Для постановки реакции диск-преципитации необходимо иметь преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, очищенный 1%-ный агаровый гель или 1%-ный агар Дифко, жидкую питательную среду, пригодную для культивирования возбудителя сибирской язвы.

3.2. Приготовление системы для постановки реакции диск-преципитации. Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку разливают по 0,5-1 мл в стерильные бактериологические пробирки. На поверхность сыворотки, по стенке пробирки, наслаивают пастеровской пипеткой расплавленный и охлажденный до 45-50°С 1%-ный агаровый гель столбиком высотой 5-7 мл. Пробирки необходимо держать в вертикальном положении до застывания агара.

На поверхность застывшего агара вносят 1-1,5 мл жидкой питательной среды. При идентификации культур, выделенных из объектов внешней среды и сырья животного происхождения, в качестве жидкой питательной среды вместо МПБ можно использовать среду ГКИ или бульон Хоттингера с 40 %-ной инактивированной сывороткой крови, в этом случае одновременно проводят исследование на капсулообразование.

Систему готовят и применяют в день постановки реакции.

3.3. Приготовление очищенного 1 %-ного агарового геля. Сначала готовят нейтральную дистиллированную воду (pH 7,0). Для этого определяют pH имеющейся дистиллированной воды и в зависимости от полученных результатов ее нейтрализуют 1 %-ным раствором соляной кислоты (при щелочной реакции).

Необходимое для нейтрализации количество раствора определяют следующим способом. К 100 мл воды небольшими порциями (миллилитрами или каплями) добавляют один из указанных растворов, постоянно определяя pH; по достижении нейтральной реакции (pH 7,0) точно рассчитывают количество раствора, необходимое для нейтрализации всего объема дистиллированной воды.

5 г агар-агара заливают 300 мл нейтральной дистиллированной воды и нагревают в кипящей водяной бане до полного расплавления агар-агара.

Одновременно готовят водный раствор белка куриного яйца.

Берут охлажденное яйцо массой не менее 56 г и отделяют белок, который тщательно взбивают до образования пенистой массы и растворяют в 200 мл нейтральной дистиллированной воды. Приготовленный раствор белка делят на две части по 100 мл.

В расплавленный агар вносят 0,5 г хлористого кальция (), перемешивают и охлаждают до 45-50°С. К смеси добавляют 100 мл водного раствора белка куриного яйца, ставят в кипящую водяную баню и нагревают (примерно 15-20 мин) до появления хлопьев (реакция коагуляции).

Если белок не свертывается или коагуляция проходит плохо, вносят еще 0,25-0,5 г хлористого кальция и продолжают нагревать до появления хлопьев.

Горячий агар фильтруют через предварительно смоченный в горячей дистиллированной воде и отжатый ватный фильтр.

К профильтрованному агару добавляют вторую часть (100 мл) водного раствора яичного белка, перемешивают и снова нагревают в кипящей водяной бане до появления хлопьев. В случае плохого свертывания белка вносят 0,25-0,5 г хлористого кальция и продолжают нагревать до получения коагуляции белка.

После свертывания белка агар вновь фильтруют в горячем виде. Очищенный 1%-ный агаровый гель должен быть прозрачным. Затем его разливают в пробирки или колбы и автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 мин. Если после стерилизации выпадает осадок, агаровый гель фильтруют и стерилизуют повторно.

Готовую среду хранят в холодильнике (2-4°С) и используют в течение 6 мес. Для предотвращения высыхания пробирки с агаровым гелем заворачивают в полиэтиленовый пакет.

4. Постановка теста "жемчужного ожерелья"

Перед постановкой теста готовят стерильный МПА и разливают в три пробирки вместимостью 10 мл (или три колбы вместимостью 100 мл).

В две пробирки (колбы) с охлажденным до 45-50°С агаром стерильно вносят пенициллин из расчета 0,5 и 0,05 ЕД на 1 мл среды. Третья пробирка контрольная.

5. Приготовление среды ГКИ

Для приготовления среды к раствору Хенкса с бикарбонатом натрия или бульону Хоттингера добавляют 40 % стерильной бычьей сыворотки крови, инактивированной при 56°С в течение 70 мин.

После смешивания компонентов pH среды доводят до 7,2-7,4 5 %-ным раствором бикарбоната натрия.

Получение необходимой концентрации пенициллина

Номер разведений	Количество разводимого пенициллина	Количество добавляемого МПБ, мл	Полученная концентрация, ЕД/мл	Количество среды
				100 мл		10 мл
				вносят раствора пенициллина, мл	концентрация пенициллина, ЕД/мл	вносят раствора пенициллина, мл	концентрация пенициллина, ЕД/мл
1	100 000 ЕД	10	10 000	-	-	-	-
2	1 мл разведения N 1	9	1000	-	-	-	-
3	1 мл разведения N 2	9	100	0,5	0,5	-	-
4	1 мл разведения N 3	9	10	0,5	0,05	0,5	0,5
5	1 мл разведения N 4	9	1	-	-	0,5	0,5

-----------------------------

^* Гризеофульвин добавляют в среду при подозрении на загрязнение материала грибами.