6. Приложение

6. Приложение

6.1. Пробирки Крейджи

Пробирки Крейджи предназначены для пассирования подвижных бактерий через полужидкий агар с целью селекции наиболее подвижных вариантов и монтируются следующим образом. В бактериологическую пробирку, содержащую примерно 7 мл полужидкого агара, опускают открытую с обоих концов стеклянную трубку с внутренним диаметром около 4-7 мм и такой длиной, чтобы, опустившись на дно пробирки, она выступала над поверхностью среды примерно на 2 см (трубки можно нарезать из пастеровских пипеток). Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и стерилизуют автоклавированием в режиме, принятом для стерилизации питательных сред. Для контроля стерильности их выдерживают в термостате при 30-37°С двое суток. До использования пробирки Крейджи можно сохранять в вертикальном положении в завязанном целлофановом пакете или в коробке с плотно закрывающейся крышкой (для уменьшения скорости усыхания среды) при комнатной температуре или в холодильнике (при температуре не ниже +1°С) до 1,5-2 месяцев, если не появятся признаки заметного усыхания верхнего слоя среды.

6.2. Полужидкий питательный агар

Полужидкий питательный агар с 0,3% содержанием агар-агара используют для селекции подвижных клеток исследуемого штамма при подготовке культуры для определения Н-антигена. Указанную концентрацию агар-агара нельзя превышать, т.к. незначительное увеличение плотности среды приводит к значительному удлинению времени миграции бактерий через полужидкий агар в пробирках Крейджи, а уменьшение концентрации ниже 0,25% не обеспечивает необходимую эффективность селекции. Среду лучше готовить на основе бульона Хоттингера (бульона Хоттингера - 1 л, агара-агара - 3 г, хлористого натрия - 4 г), но можно применять бульон, приготовленный на любой другой питательной основе, обеспечивающей хороший рост эшерихий. Среду используют в обычных бактериологических пробирках или пробирках Крейджи. Застывшую в пробирках среду нельзя встряхивать, т.е. нарушать ее целостность, т.к. образующиеся в ней невидимые трещины заполняются жидкостью, что исключает возможность эффективной селекции наиболее подвижных вариантов бактерий.

6.3. Плотная питательная среда

Среду готовят из сухого питательного агара на рыбном гидролизате, используя дозировку 5 г сухого порошка на 100 мл дистиллированной воды. Добавляют 2-5% глицерина (2-5 мл на 100 мл среды), размешивают, прогревают при 100°С до полного расплавления порошка, разливают в чистые бактериологические пробирки по 4-5 мл и стерилизуют автоклавированием 20 минут при 121°С. Пробирки со стерильной расплавленной средой оставляют под углом для образования скошенной поверхности среды после ее застывания или в вертикальном положении. Не использованные пробирки со скошенной средой сохраняют до 7 дней, а среду, застывшую столбиком - до 4 недель при +4 - +10°С. Среду, застывшую столбиком, перед использованием растапливают на водяной бане и скашивают. При необходимости можно стерильный глицерин (121°С, 20 мин) добавлять в стерильную, не содержащую глицерина среду в выше указанной пропорции. Помимо агара на основе рыбного гидролизата можно использовать среду, состоящую из 25 г сухого кислотного гидролизата казеина, 20 г сухого дрожжевого экстракта и 15 г агар-агара на 1 литр дистиллированной воды с добавкой 2-5% глицерина.

При отсутствии глицерина можно применять 1,2-1,5% агар Хоттингера с добавкой 0,2-0,4% глюкозы. Можно использовать выпускаемый в ампулах для внутривенного введения 40% раствор глюкозы (0,5-1 мл на 100 мл среды). Глюкозу добавляют к расплавленной стерильной среде, перемешивают, разливают в бактериологические пробирки по 4-5 мл. Пробирки оставляют для затвердения среды под таким углом, чтобы скошенная поверхность среды доходила до дна пробирки.

6.4. Диагностические сыворотки

Агаровые культуры в реакции агглютинации на стекле способны реагировать не только с Н-, но и с О- или K-антителами. Поэтому сыворотки, применяемые для определения Н-антигена, не должны содержать антител к соматическим антигенам исследуемых штаммов. Этому условию отвечают выпускаемые в нашей стране (предприятие Центрального НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова) в высушенном виде диагностические эшерихиозные Н-сыворотки, предназначаемые для идентификации Н-антигена у энтеропатогенных разновидностей эшерихий методом иммобилизации в полужидком агаре, которые при изготовлении специально контролируются на отсутствие антител к соматическим антигенам эшерихий соответствующих О- (OK)-групп. Эти препараты позволяют определять 15 наиболее часто встречающихся Н-антигенов и состоят из 4-х поливалентных смесей: НА (Н2, Н6, Н11), НВ (Н12, Н30, Н32), НС (Н4, Н9, Н10, Н21, Н34) и НД (Н7, Н19, Н25, Н"635"), - и 15-ти соответствующих моновалентных сывороток.

Сухую сыворотку, содержащуюся в ампуле, растворяют в изотоническом растворе хлористого натрия (рН = 6,8-7,2), взятом в 1/3 объема, указанного на этикетке для полужидкого агара. Растворенные сыворотки сохраняют свою специфическую активность при температуре +4 - +10°С до 1,5 месяца.