Приложение (справочное). Методы оценки иммунотоксичности

Приложение
(справочное)

Методы
оценки иммунотоксичности

1 Стандартные исследования токсичности

В таблице перечислены параметры, которые следует оценивать в рамках стандартных исследований токсичности на предмет признаков иммунотоксичности.

Таблица - Оцениваемые параметры в рамках стандартных исследований токсичности

Параметр	Специфический компонент
Гематология	Общее и абсолютное дифференциальное количество лейкоцитов
Клиническая химия	Уровень глобулина*(1) и соотношение A/G
Макропатология	Лимфоидные органы и ткани
Масса органов	Тимус, селезенка (необязательно: лимфатические узлы)
Гистология	Тимус, селезенка, дренирующий лимфатический узел и минимум один дополнительный лимфатический узел, костный мозг*(2), пейеровы бляшки*(3), BALT*(4), NALT*(4)
*(1) Необъяснимое изменение уровня глобулина может потребовать измерения уровня иммуноглобулинов. (2) Необъяснимое изменение гистопатологических характеристик линий клеток периферической крови может свидетельствовать о целесообразности цитологической оценки костного мозга. *(3) Только для приема внутрь. *(4) Только для ингаляционного или назального введения. BALT - лимфоидная ткань, ассоциированная с бронхами. NALT - назально-ассоциированная лимфоидная ткань.

1.1 Гематология и клиническая химия

Подсчет общего числа лейкоцитов и абсолютный дифференцированный подсчет лейкоцитов необходимы для оценки иммунотоксичности. При оценке изменения уровня глобулина следует учитывать другие факторы (например, токсическое воздействие на печень, нефротоксичность). Изменение уровня глобулина в сыворотке может свидетельствовать о наличии изменения уровня иммуноглобулинов в сыворотке. Несмотря на то, что уровень иммуноглобулинов в сыворотке не является чувствительным индикатором иммуносупрессии, изменение уровня иммуноглобулина может быть полезным в некоторых ситуациях, обеспечивая более точное понимание популяций клеток-мишеней и механизма действия препарата.

1.2 Макропатология и масса органов

При вскрытии необходимо исследовать лимфоидные ткани на предмет макроскопических изменений и регистрировать массу тимуса и селезенки. При некропсии у собак и обезьян рекомендовано полное обескровливание животных для сведения к минимуму вариабельности массы селезенки.

1.3 Гистопатологическое обследование

Гистопатологические изменения селезенки и тимуса следует оценивать в качестве индикатора системной иммунотоксичности. Должна быть исследована лимфоидная ткань, осуществляющая дренаж либо контактирующая с участком введения препарата (а следовательно, подверженная наибольшим концентрациям препарата). К таким участкам относятся пейеровы бляшки и мезентерические лимфатические узлы в случае препаратов, принимаемых внутрь, и лимфоидная ткань, ассоциированная с бронхами (BALT), - для препаратов, вводимых в виде ингаляции, и назально-ассоциированная лимфоидная ткань (NALT) для препаратов, вводимых путем ингаляции или интраназально (если это возможно), и наиболее проксимальные регионарные дренажные лимфатические узлы для препаратов, применяемых накожно, внутримышечно, внутрикожно, интратекально или подкожно. Выбор конкретного лимфатического узла и дополнительного лимфатического узла происходит по усмотрению спонсора на основании имеющегося у него опыта. Для препаратов, вводимых внутривенно, в качестве дренажной лимфоидной ткани рассматривают селезенку.

При регистрации изменений и сообщении о лекарственно-обусловленном изменении лимфоидных тканей рекомендовано проводить полуколичественное описание изменений в компартментах лимфоидных тканей.

1.4 Интерпретация изменений, вызванных стрессом

При проведении стандартных исследований токсичности дозы, близкие к максимально переносимой дозы, могут приводить к стресс-обусловленному изменению иммунной системы (например, к избыточному фармакодинамическому действию). Воздействия на иммунную систему могут быть опосредованы усиленным высвобождением кортикостерона либо кортизола или других медиаторов. К частым стресс-опосредованным иммунным изменениям относят рост уровня циркулирующих нейтрофилов, снижение уровня лимфоцитов в циркулирующей крови, массы тимуса, клеточности коркового вещества тимуса и связанные с ним гистопатологические изменения, а также изменения клеточного содержимого селезенки и лимфатических узлов. Также отмечен рост массы надпочечников и/или гистологических признаков гиперплазии коры надпочечников. Снижение массы тимуса при наличии клинических признаков, таких как снижение массы тела и физической активности, также относили на стрессовые ситуации. Эти результаты сами по себе не являются достаточным свидетельством стресс-опосредованной иммунотоксичности. Признаки стресса должны быть достаточно убедительными, чтобы представлять собой достаточное основание для отказа от проведения дополнительных исследований иммунотоксичности.

Обычно наблюдаемые, связанные со стрессом иммунные изменения включают: увеличение циркулирующих нейтрофилов, уменьшение циркулирующих лимфоцитов, снижение массы тимуса, снижение тимозной кортикальной клеточности и связанные с ней гистопатологические изменения и изменения клеточной плотности селезенки и лимфатических узлов.

2 Дополнительные исследования иммунотоксичности

2.1 Характеристика и валидация анализа

Обычно выбирают широко применяемые методики проведения теста иммунотоксичности, показавшие достаточную чувствительность и специфичность по отношению к иммуносупрессивным веществам. Однако в некоторых ситуациях методики могли не пройти достаточной валидации, а анализ мог не быть широко используемым. В таких ситуациях необходимо научное/механистическое основание для использования данного метода анализа; при необходимости следует использовать положительный контроль.

Могут существовать колебания ответа для каждого типа испытания иммунотоксичности, используемого различными лабораториями. В большинстве случаев изменения не влияют на способность к оценке иммунотоксичности. Однако для обеспечения необходимого качества выполнения анализа и профессионализма лаборатории следует соблюдать несколько стандартных технических параметров валидации. Эти параметры включают определение прецизионности внутри одного опыта и в серии опытов, прецизионность при проведении анализа разными лаборантами, предел количественного определения, линейный участок количественного определения и стабильность исследуемого образца. Кроме того, следует установить чувствительность анализа к известным веществам с иммуносупрессивным действием. Рекомендовано проводить каждый лабораторный тест с положительным контрольным препаратом параллельно экспериментальным либо проводить такие испытания периодически для подтверждения эффективности методики, кроме исследований, проводимых на приматах. При иммунофенотипировании, при условии надлежащей технической валидации, включение положительных контрольных образцов в каждое исследование может не потребоваться.

Исследования иммунотоксичности должны проводить в соответствии с требованиями надлежащей лабораторной практики. Некоторые специализированные анализы, например из числа описанных ниже, могут не соответствовать полностью требованиям GLP.

2.2 Т-клеточно зависимый гуморальный иммунный ответ (TDAR)

Анализ TDAR следует проводить при помощи установленного Т-клеточно зависимого антигена [например, эритроциты овцы (SRBC) или гемоцианин лимфы улитки (KLH)], приводящего к достижению стойкого ответа антител. Выбранная конечная точка должна быть обоснована в качестве наиболее подходящей для выбранного анализа и биологического вида.

Антигены для иммунизации не следует использовать с адъювантами без надлежащего основания. Алюминий можно использовать только в исследованиях на приматах. Относительный ответ TDAR может зависеть от линии животных, особенно в случае исследований на мышах. В случае аутбредных крыс может иметь место значительная вариабельность между крысами внутри одной группы. Инбредные линии крыс можно использовать при условии достаточных данных для сопоставления с линиями животных в СИТ.

Антитела можно определять при помощи ELISA или других методик иммунного анализа. Одним из преимуществ данного метода над ответом со стороны антителообразующих клеток является то, что образцы можно собирать периодически в течение всего периода проведения исследования. У обезьян серийный сбор клеток крови играет большую роль благодаря высокой вариабельности кинетических параметров ответа у разных животных. В этих исследованиях данные могут быть выражены в виде суммы ответа антител для нескольких дней сбора (например, площадь под кривой).

Если для анализа ELISA используют антигены SRBC, использование иммобилизованного антигена в плашках - критически важный момент. В качестве иммобилизованного антигена SRBC можно использовать цельные фиксированные эритроциты или мембранные препараты. Результаты анализа ELISA следует выражать либо в виде концентрации, либо в виде титра, а их выражение в единицах оптической плотности не рекомендовано.

2.3 Иммунофенотипирование

Иммунофенотипирование - это идентификация и/или подсчет групп лейкоцитов при помощи антител. Иммунофенотипирование, как правило, проводят методом флоуцитометрического анализа или иммуногистохимических методов.

Проточная цитометрия, используемая для подсчета определенных популяций клеток, не является функциональным методом анализа. Однако проточную цитометрию можно применять для определения антиген-специфического иммунного ответа со стороны лимфоцитов. Данные периферической крови могут представлять собой полезный мост для клинических исследований, в которых также проводят оценку лейкоцитов периферической крови. Рекомендовано при оценке изменений, обусловленных терапией, учитывать абсолютное количество подгрупп лимфоцитов, а также процентные соотношения.

Одним из преимуществ иммуногистохимического анализа над проточной цитометрией является то, что ткани стандартных исследований токсичности могут быть подвержены ретроспективному анализу при наличии признаков иммунотоксичности. Некоторые маркеры лимфоцитов для определенных видов чувствительны к фиксации формалином и могут быть локализованы только в тканях, фиксированных определенными фиксаторами, либо в быстрозамороженных тканях. Количественное определение лейкоцитов и интенсивность окрашивания оценить при использовании иммуногистохимического метода гораздо труднее.