Приложение Г (рекомендуемое). Проверка пригодности тест-объектов для биотестирования

Приложение Г
(рекомендуемое)

Проверка пригодности тест-объектов для биотестирования

Г.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

Г.1.1 Колбы мерные 2-го класса точности исполнения 2, 2а по ГОСТ 1770-74 вместимостью: 100 - 12 шт., 250 - 6 шт; 500 - 6 шт.

Г.1.2 Пипетка с одной отметкой 2-го класса точности исполнения 2 по ГОСТ 29169-91 вместимостью 2 , 5 , 10 , 20 - 4 шт.

Г.1.3 Колбы конические типа Кн исполнения 2 по ГОСТ 25336-82 вместимостью 250 - 12 шт., 500 - 6 шт.

Г.1.4 Весы неавтоматического действия среднего (III) класса точности по ГОСТ Р 53228-2008, максимальная нагрузка не более 500 г, дискретность отсчета 0,001 г.

Г.1.5 Калий двухромово-кислый по ГОСТ 4220-75.

Г.1.6 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Г.1.7 Вода водопроводная дехлорированная.

Г.2 Проверка пригодности тест-объектов для биотестирования

Г.2.1 Перед выполнением биотестирования проверяют пригодность тест-объектов по их чувствительности к эталонному токсиканту. При систематическом выполнении работ по биотестированию такая проверка проводится не реже одного раза в месяц.

В случае, когда показателем токсичности служит выживаемость (гибель) тест-объектов, определяют за 24 ч экспозиции, т.е. концентрацию эталонного токсиканта, при которой погибает 50% особей тест-объекта.

Для водорослей, у которых показателем токсичности служит скорость роста (увеличение численности клеток), определяют эффективную концентрацию эталонного токсиканта, вызывающую снижение численности водорослей на 50% по сравнению с контролем за 48 ч экспозиции.

Как показывает практика токсикологических исследований, показатели и взятой в эксперимент выборки культуры тест-объекта могут быть установлены при нескольких концентрациях эталонного токсиканта, находящихся в определенном, характерном для каждого тест-объекта, узком диапазоне.

Г.2.2 В качестве эталонного токсиканта чаще всего используют калий двухромовокислый .

Для установления чувствительности тест-объекта готовят исходный раствор с концентрацией 10 . Для этого взвешивают 5 г , переносят в мерную колбу вместимостью 500 и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем доводят содержимое колбы до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Приготовленный исходный раствор перед использованием выдерживают в течение двух часов. Срок хранения исходного раствора калия двухромовокислого в темной склянке с притертой пробкой - не более 6 месяцев.

Далее готовят рабочий раствор с концентрацией 0,05 (50 ). Для этого в мерную колбу вместимостью 500 приливают 2,5 исходного раствора 10 пипеткой вместимостью 5 , доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Рабочий раствор хранению не подлежит.

Г.2.3 Показатель за 48 ч для зеленых водорослей должен находиться в диапазоне концентраций от 1,3 до 2,5 . Для установления готовят серию градуировочных растворов калия двухромовокислого с концентрациями 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 следующим образом. В мерные колбы вместимостью 250 приливают соответственно по 1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 10,5; 12,5 рабочего раствора с концентрацией 50 , используя пипетки вместимостью 2, 5, 10 и 20 . В каждую колбу приливают до метки дистиллированную воду и тщательно перемешивают полученные растворы.

В конические колбы вместимостью 250 приливают мерной колбой вместимостью 100 по 100 каждого градуировочного раствора, 0,1 питательной среды, суспензию водорослей в объеме, чтобы численность клеток в каждой из трех колб находилась в пределах от до 50х10 и проводят биотестирование в соответствии с 7.1. Каждую концентрацию в соответствии с 7.1. Каждую концентрацию берут в двух повторностях. В качестве контроля используют соответствующую питательную среду. Через 48 ч определяют численность водорослей и устанавливают графическим методом с использованием пробитного анализа в соотвествии Р 52.24.662.

Если значение показателя выходит за рамки установленного диапазона концентраций эталонного токсиканта, повторяют эксперимент с использованием другой культуры водорослей.

Г.2.4 Для установления пригодности к биотестированию дафний и цериодафний используют те же концентрации эталонного токсиканта, что и для водорослей, однако рабочий и градуировочные растворы готовят на дехлорированной водопроводной воде. В качестве контроля используют дехлорированную водопроводную воду. Биотестирование на этих растворах проводят (каждый в трех повторностях) в течение 24 ч и на основании полученных результатов рассчитывают за 24 ч с помощью графического метода и пробитного анализа в соответствии с Р 52.24.662. Показатель за 24 ч для дафний должен находиться в диапазоне концентраций от 0,9 до 2,0 , для цериодафний - от 1,2 до 1,9 .

Если значение показателя выходит за рамки установленного диапазона концентраций эталонного токсиканта, повторяют эксперимент с использованием организмов из других культур.

Г.2.5 Для установления пригодности к биотестированию парамеций и коловраток готовят градуировочные растворы эталонного токсиканта в концентрациях 0,025; 0,050; 0,075; 0,100; 0,200; 0,250 следующим образом. Из исходного раствора с концентрацией 10 готовят рабочий раствор с концентрацией 5 : в мерную колбу вместимостью 500 приливают 0,5 исходного раствора и доводят до метки дехлорированной водопроводной водой. Далее берут 6 мерных колб вместимостью 100 , приливают в каждую колбу соответственно по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0 и 5,0 рабочего раствора с концентрацией 5 и доводят до метки дехлорированной водой, получая градуировочные растворы в концентрациях 0,025; 0,050; 0,075; 0,100; 0,200; 0,250 . Эти растворы используют для установления при экспозиции 24 ч для культуры парамеций или коловраток при биотестировании в соответствии с методикой. В качестве контроля используют дехлорированную водопроводную воду. Расчет показателя производят графическим методом с использованием пробитного анализа по Р 52.24.662. Показатель за 24 ч для парамеций и коловраток должен находиться в диапазоне концентраций от 0,075 до 0,250 .

Если значение показателя выходит за рамки установленного диапазона концентраций эталонного токсиканта, повторяют эксперимент с использованием организмов из других культур.