Приложение. Методика постановки иммунологических реакций

Приложение

Методика
постановки иммунологических реакций

1. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Реакцию ставят с диагностикумом, представляющим собой эритроциты барана, обработанные формалином и таниновой кислотой и нагруженные антигеном-жидкостью из эхинококковых пузырей овец.

1.1. Получение и обработка эритроцитов. В стерильную мерную бутыль (250-500 мл), содержащую 15-20 стеклянных бус, вливают 150-200 мл крови, взятой стерильно из яремной вены барана, и встряхивают 15 мин. Дефибринированные таким образом эритроциты отмывают три раза физиологическим раствором, фильтруют через воронку с одним слоем стерильной марли и измеряют объем полученной массы, который принимают за 50%-ную взвесь эритроцитов. Из этой взвеси готовят 8%-ую взвесь (1 объем взвеси эритроцитов - 6 объемов фосфатно-солевого буфера - рН 7,2), соединяют с равным объемом 3% раствора формалина (1000 мл фосфатно-солевого буфера + 80 мл 38-40% формальдегида). При соединении вливать 3% формалин в эритроцитарную взвесь, слегка встряхивая последнюю. Колбу со смесью выдерживают на водяной бане при 37°С в термостате 2-3 часа, перемешивая (взбалтывая) каждые 15 мин, после чего оставляют в термостате (при 37°С) до следующего дня. На следующий день смесь центрифугируют в больших стеклянных стаканах (пробирках), надосадочную жидкость сливают, а осадок трижды отмывают фосфатно-солевым буфером путем центрифугирования при 2-3 тыс. об./мин в течение 15-20 мин. Осадок ресуспензируют до первоначального объема фосфатно-солевым буфером и добавляют формалин (38-40% формальдегид - нейтральный) в количестве, необходимом для доведения до 0,5%.

Процент содержания эритроцитов определяют по количеству осадка после центрифугирования в градуированной центрифужной пробирке (6-7%). Полученную взвесь эритроцитов разливают в стерильную посуду (по 50-100 мл), герметически закрывают и хранят в холодильнике при 4°С. Формалинизированные эритроциты сохраняют свою активность более года.

1.2. Антиген. Антигеном служит стерильно полученная, прозрачная жидкость из эхинококковых пузырей овец, которую хранят в запаянных (по 3-5 мл) стерильных ампулах в замороженном состоянии. Каждую новую серию жидкости проверяют на активность, путем приготовления пробных серий диагностикумов с различными разведениями жидкости (1:2, 1:4, 1:8) и постановки реакции с референс-сыворотками и отрицательной (контрольной) сывороткой. Активной считается жидкость, давшая наивысший титр (не менее 1:40 960) с референс-сывороткой и отрицательный с контрольной.

В качестве референс-сыворотки используют смесь сывороток больных эхинококкозом и альвеококкозом (раздельно), давших высокие титры реакции с эхинококковым диагностикумом. Контрольной служит сыворотка крови здорового кролика.

1.3. Приготовление диагностикума. Взвесь формалинизированных эритроцитов барана, хранящуюся в холодильнике, хорошо взбалтывают (до распадения осадка) и готовят из нее требуемое количество (например 40 мл) 2,5% взвеси.

Расчет по формуле (исходная взвесь) мл (для получения 40 мл 2,5% взвеси требуется 16,6 мл 6% взвеси).

2,5% взвесь эритроцитов в фосфатно-солевом буфере центрифугируют при 2,5-3 тыс. об. мин, в течение 5 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок трижды отмывают 0,9% раствором NaCl. После последнего отмывания осадок эритроцитов ресуспензируют фосфатно-солевым буфером (до 40 мл), и соединяют в колбе с равным объемом (по 40 мл) таниновой кислоты в разведении 1:20 000 (0,2 ранее, разведенной 1:100 на 39,8 фосфатно-солевого буфера). Смесь ставят на водяную баню в термостат при 37°С на 30 мин (через 15 минут колбу со смесью встряхивать), после чего центрифугируют в большой пластмассовой пробирке при 2-2,5 тыс. об./мин в течение 3-5 мин. осадок трижды отмывают 0,9% раствором NaCl. К осадку добавляют фосфатно-солевой буфер, доводя до первоначального объема (40 мл). Половину из полученных таким образом танизированных эритроцитов отмеряют и к ней добавляют мертиолат (в разведении 1:100) из расчета 0,1 на 10 мл эритроцитов. Вторую часть танизированных эритроцитов для сенсибилизации соединить с равным объемом антигена (эхинококковой жидкости) в установленном ранее разведении. Смесь выдерживают 1,5-2 часа на водяной бане в термостате при 37°С, встряхивая каждые 15-20 мин, после чего смесь центрифугируют в течение 5 мин. при 2-2,5 тыс. об./мин. Осадок трижды отмывают физиологическим раствором и восстанавливают до первоначального объема (20 мл) фосфатно-солевым буфером. К полученному таким образом, эхинококковому эритроцитарному диагностикуму добавляют мертиолат с конечным содержанием его 1:10 000 по 0,1 мл в разведении его 1:100 на каждые 10 мл диагностикума. Диагностикум хранят в герметически закрытом стеклянном сосуде при 4°С. Активность его сохраняется в течение 4-6 мес. Для более длительного хранения эритроцитарного диагностикума его можно подвергать лиофильной сушке. Для этого определенный объем диагностикума (например 40 мл) центрифугировать при 2,5 тыс. об./мин в течение 5-10 мин (до полного осаждения эритроцитов). Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют половинное количество (20 мл) 2,5% раствора сахарозы на дистиллированной воде. Смесь разливают по 1 мл в ампулы и подвергают лиофильной сушке.

1.4. Постановка реакции. В центрифужных пробирках (число которых равно числу используемых сывороток) развести в смеси фосфатно-солевого буфера с нормальной сывороткой кролика (1:100) испытуемые и контрольные сыворотки 1:20 (0,1 сыворотки на 2 мл буфера). Пробирки с разведенной сывороткой закрыть ватой и инактивировать при 57°С в течение 30 мин.

В лунки хорошо вымытых и протертых плашек из плексигласа разлить по 0,3 мл буфера, из расчета на каждую сыворотку по 2 ряда лунок. В первые лунки каждого ряда добавить 0,3 мл испытуемой инактивированной сыворотки в разведении 1:20, и титровать ее, перемешивая и перенося 0,3 мл сыворотки из первой лунки во вторую, из второй - в третью и так до конца ряда; из последней лунки 0,3 мл сыворотки вылить. Таким образом получено разведение сыворотки от 1:40 до 1:81 920. Для каждой исследуемой сыворотки использовать отдельную пипетку. К первому ряду исследуемых сывороток добавить по 1 капле диагностикума, а во второй ряд - по 1 капле танизированных эритроцитов (контроль 1). При постановке реакции с лиофилизированным препаратом сухой осадок в ампуле развести в 2 мл дистиллированной воды и вносить, как в жидкий препарат, по 1 капле в каждую лунку. Контролем 2 (3-4 лунки) служит смесь 0,3 мл нормальной сыворотки кролика и фосфатно-солевого буфера +1 капля танизированных эритроцитов контроль 3-0,3 той же смеси + 1 капля диагностикума. Контроль 4 - заведомо положительная сыворотка в разведениях с 1:40 до 1:81 920 + 1 капля диагностикума в каждую лунку. Контроль 5 - отрицательная (контрольная) сыворотка в разведениях с 1:40 до :81 920 + 1 капля диагностикума в каждую лунку. Плашки встряхивают поколачиванием боковой стороной ладони до полного смешения сыворотки и эритроцитов.

Учет результатов производят на следующий день (после выдерживания плашек при комнатной температуре) по расположению эритроцитов на дне лунки.

Реакция положительная (4+ или 3+), склеенные эритроциты покрывают дно лунки в виде зонтика (зонтик шире 4+, несколько уже 3+).

Реакция отрицательная - зонтик узкий (2+), при образовании пуговки - с просветом в центре (1+), без просвета (-).

Диагностический титр реакции 1:320. Образование зонтика на 4+ и 3+ в разведениях 1:40 и 1:80 - сомнительный результат.

Учет реакции производят только при отрицательном результате в 1, 2, 3, 5 контроля и при положительном результате в титре не менее, чем 1:20 480 в контроле 4.

Титр сыворотки устанавливают по последнему разведению, давшему положительный результат.

Реакцию можно ставить с сухой кровью (вместо сыворотки), взятой из пальца в объеме 0,2 мл на бумагу (тетрадную или кальку) и высушенную на воздухе. Сухую каплю крови растворить в течение 2-3 часов в 2 мл разведенной в буфере сыворотки здорового кролика (1:100), далее титровать, ставить и оценивать по вышеописанной методике.

2. Реакция латекс агглютинации (РЛА)

РЛА ставят с эхинококковым латексным диагностикумом, выпускаемым Ставропольским НИИ вакцин и сывороток. Диагностикум надо беречь от замерзания, хранить при +4°С.

2.1. Методика постановки реакции.

Для каждой исследуемой и контрольной сывороток установить в штатив по 5 пробирок. Все сыворотки разводят боратно-солевым буфером (РН 8,2) в последовательных двойных разведениях от 1:4 до 1:64. Для этого в 1 из 5 пробирок каждого ряда налить 0,75 мл, а в остальные - по 0,5 мл буфера и добавить в каждую первую пробирку 0,25 мл исследуемой сыворотки, отмеряя каждую сыворотку отдельной стерильной пипеткой на 1-2 мл. Перемешать сыворотку с буфером и 0,5 смеси перелить во вторую пробирку, снова перемешать и 0,5 смеси перелить в третью пробирку и так до конца ряда. Из последней пятой пробирки 0,5 смеси вылить. К каждому разведению сыворотки добавить 0,5 мл диагностикума, тщательно встряхнуть и штатив с пробирками поместить сначала на 3 часа в термостат при 37°С, а затем - на ночь в холодильник при 4°С. На следующий день пробирки центрифугируют 5 мин при 2 тыс. об./мин, и просматривают под лупой с увеличением, в 2-3 раза, оценивая реакцию по количеству образовавшегося осадка, цвету надосадочной жидкости и размеру хлопьев.

Контроль I (диагностикума) : 0,5 боратно-солевого буфера + 0,5 диагиостикма (одна пробирка).

Контроль II (специфичности) : сыворотка нормального кролика, которую разводят (с 1:4 до 1:64) и исследуют так же, как испытуемые сыворотки (пять пробирок).

Контроль III (активности) : заведомо положительная сыворотка, которую разводят (с 1:4 до 1:64) и исследуют так же, как испытуемые сыворотки (пять пробирок). Показатели реакции считаются достоверными при отрицательном результате контролей I и II. В контроле III (реакция с заведомо положительной сывороткой) должна быть ясно выраженная агглютинация в титре не менее чем 1:32.

2.2. Оценка результатов.

При полном выпадении осадка, состоящего из крупных флоккул, и прозрачной надосадочной жидкости, реакцию оценивают как резко положительную (4+ и 3+).

При положительной реакции надосадочная жидкость слегка мутновата, осадок состоит из мелких флоккул (2+ , 1+). При отрицательной реакции жидкость в пробирках равномерно мутная, осадка нет (-). Титр сыворотки устанавливают по последнему ее разведению, давшему положительный результат.

Диагностический титр реакции 1:8.

Микрометод реакции непрямой гемагглютинации

Для микрометода РНГА помимо реактивов и оборудования, указанных для макрометода, требуется следующее:

1. 1%-й раствор желатины на ФСБ рН 7.2 (сухую желатину растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды и оставляют на 40-50 минут для набухания, нагревают на водяной бане при 80-90°С до полного растворения, не допуская кипения, и разводят в 100 мл ФСБ рН 7.2) - жидкость для разведения.

2. Планшеты для иммунологических реакций.

3. Аппарат Такачи.

Постановка и учет реакции

В лунки двух первых рядов планшета вносят по 0,02 мл жидкости для разведения и первую лунку каждого ряда заполняют 0,02 мл испытуемой сыворотки, предварительно разведенной 1:2 жидкостью для разведения и инактивированной при 56°С в течение 30 минут.

Из разведенной инактивированной сыворотки готовят дальнейшие разведения: в первом ряду от 1:4 до 1:8192, во втором ряду (контрольном) от 1:4 до 1:128.

В лунки первого ряда вносят по 1 капле эхинококкового диагностикума, в лунки второго ряда - по 1 капле эритроцитов, обработанных таниновой кислотой (см. макрометод РНГА). Лиофилизированные диагностикум и эритроциты предварительно разводят из расчета 1 ампула сухого препарата на 6 мл стерильной дистиллированной воды.

Реакцию учитывают через 1 час.

Диагностическим титром считается разведение сыворотки 1:32 при интенсивности реакции не менее ++. Контроли те же, что и при макрометоде.

Преимуществом микрометода является использование меньшего количества ингредиентов, чем при макрометоде (диагностикума в три раза, жидкости для разведения в десять раз) и скорость получаемого ответа.

Отрывной лист
учета использования методов профилактики диагностики и лечения

Направить по подчиненности

      1. Методические  рекомендации  по  диагностике,  клинике,  терапии,

эпидемиологии, профилактике эхинококкоза и альвеококкоза.

      2. ________________________________________________________________

                              (кем и когда утвержден)

      3. ________________________________________________________________

                               (кем и когда получен)

      4. Количество лечебно-профилактических учреждений, которые внедрили

методы  профилактики,  диагностики   и   лечения,   предложенные   данным

документом ______________________________________________________________

      5. Формы   внедрения   (семинары,   подготовка   и   переподготовка

специалистов, сообщения и пр.) и результаты применения метода (количество

наблюдений за 1 год и эффективность) ____________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

      6. Замечания и пожелания (текст) __________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

      Подпись ___________________________________________________________

                   (должность, Ф.,И.,О. лица, заполнявшего карту)