Приложение А (справочное). Рабочие стандарты для оценки кожной сенсибилизации в аналогичных или модифицированных LLNA

Приложение А
(справочное)

Рабочие стандарты для оценки кожной сенсибилизации в аналогичных или модифицированных LLNA

А.1 Введение

А.1.1 Назначение рабочих стандартов (PS) состоит в том, чтобы проинформировать пользователей о новых экспериментальных методах, запатентованных (т.е. защищенных авторским правом, имеющих официально зарегистрированную торговую марку и зарегистрированных) и незапатентованных, которые могут быть определены как имеющие достаточную точность и надежность для специфических целей эксперимента. Данные PS на основе утвержденных и принятых методов испытаний могут быть использованы для оценки надежности и точности аналогичных методов испытания (в разговорной речи именуемых "похожий метод"), которые основаны на одних и тех же научных принципах и оценивают или прогнозируют тот же биологический или токсический эффект [14].

А.1.2 До принятия модифицированных методов испытания (т.е. предложенных потенциальных усовершенствований к утвержденному методу испытания) следует проводить оценку эффективности предложенных изменений и степени, в которой эти изменения влияют на другие компоненты процесса валидации. В зависимости от количества и характера предлагаемых изменений, полученных с их использованием, и подтверждающей документации для этих изменений, измененный метод подвергается полной процедуре валидации точно так же, как все новые методы испытаний, или, если это будет признано возможным, сокращенной процедуре оценки достоверности и обоснованности с использованием утвержденных PS [14].

А.1.3 Аналогичные или модифицированные методы испытания, предлагаемые для использования в соответствии с настоящим стандартом, должны быть подвергнуты оценке для определения их надежности и точности с использованием химических соединений, соответствующих полному диапазону балльной оценки LLNA. Для предотвращения необоснованного использования животных настоятельно рекомендуется основываться на принципах OECD до начала валидационного исследования в соответствии с PS и методологическими принципами, приведенными в настоящем стандарте.

А.1.4 Эти PS основаны на гармонизированных нормативных требованиях "Межведомственного координационного комитета по валидации альтернативных методов" (US-ICCVAM, EC-ECVAM и Japanes-JaCVAM) [12] к оценке достоверности аналогичных или модифицированных версий LLNA. В состав PS включены обязательные компоненты метода испытаний, рекомендуемые эталонные вещества и стандарты точности и надежности, которым должен соответствовать или превосходить предлагаемый метод испытаний.

А.2 Основные компоненты метода испытания

Для обеспечения функционального и механического соответствия аналогичного или модифицированного метода LLNA исходному методу LLNA оценивают один и тот же биологический эффект. В протокол метода испытаний должны быть включены следующие критерии:

- исследуемое вещество, которое должно быть нанесено на поверхность обоих ушей мыши;

- пролиферация лимфоцитов, которую следует определять в лимфатических узлах, дренирующих участок аппликации исследуемого вещества;

- пролиферация лимфоцитов, которую следует определять в течение фазы индукции кожной сенсибилизации;

- самая высокая доза исследуемого вещества, которая должна быть максимальной концентрацией, не вызывающей проявления системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи мышей. Для позитивных контролей самая высокая доза должна давать значение ЕС3 и при этом не вызывать симптомов системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи мышей (см. таблицу А.1);

- параллельный VC должен быть включен в каждое исследование, а при необходимости - параллельный PC;

- на каждую дозу следует использовать не менее четырех животных;

- данные могут быть получены как по отдельным животным, так и объединены по группам.

При отсутствии соответствия по любому из этих критериев данный PS не может быть использован для валидации аналогичного или модифицированного метода испытания.

А.3 Минимальный перечень эталонных веществ

Методы US-ICCVAM, EC-ECVAM и Japanes-JaCVAM, гармонизированные с PS [12], устанавливают не менее 18 основных эталонных веществ, которые рекомендованы к использованию, и четырех дополнительных веществ, которые могут давать ложноположительные или ложноотрицательные эффекты в LLNA по документу [13].

При выборе этих веществ следует руководствоваться следующими критериями:

- в список эталонных должны быть включены вещества, как правило, исследуемые на потенциальную возможность кожной сенсибилизации в диапазоне эффектов, которые LLNA способен измерять или прогнозировать;

- вещества должны иметь точно определенную химическую структуру;

- для этих веществ должны быть доступны данные LLNA, полученные в результате опытов на морских свинках по документу [13], и (при наличии) данные участников экспериментов;

- вещества должны быть в продаже.

Рекомендуемые эталонные вещества приведены в таблице А.1. Исследования с использованием предложенных эталонов следует проводить с растворителями, приведенными в таблице А.1. При недоступности данных веществ можно использовать другие вещества, соответствующие вышеуказанным критериям отбора.

А.4 Характеристика стандартов надежности и точности

А.4.1 Точность аналогичного или модифицированного метода испытаний LLNA должна соответствовать или превосходить точность PS LLNA, при этом сравнение должно быть проведено по результатам испытания с использованием полной минимальной базы, состоящей из 18 эталонных веществ. Новый или модифицированный метод LLNA должен правильно классифицировать эти эталонные вещества по принципу "да/нет", однако новый или модифицированный метод LLNA не сможет правильно классифицировать все используемые эталонные вещества.

Если, например, один из слабых сенсибилизаторов классифицирован неверно, необходимо представить обоснование неправильной классификации данного эталонного вещества и соответствующие дополнительные данные (например, результаты испытаний, обеспечивающих правильную классификацию других веществ, сходных с неверно классифицированным эталонным веществом по физическим, химическим и сенсибилизирующим свойствам), для того чтобы продемонстрировать эквивалентность результатов исследований.

При таких обстоятельствах результаты валидации нового или модифицированного метода испытаний LLNA должны быть оценены в каждом конкретном случае индивидуально.

А.4.2 Внутрилабораторная воспроизводимость

Внутрилабораторную воспроизводимость для нового или модифицированного методов испытаний LLNA определяют с использованием сенсибилизирующего вещества, хорошо охарактеризованного в настоящем методе. Поэтому PS LLNA основаны на вариативности результатов повторных испытаний гексилкоричного альдегида (НСА). Для оценки внутрилабораторной надежности должны быть получены значения предельной пороговой концентрации (ECt) для гексилкоричного альдегида (НСА) в четырех отдельных экспериментах с интервалом не менее одной недели между испытаниями. Приемлемая внутрилабораторная воспроизводимость соответствует значению пороговой концентрации (ECt) от 5 % до 20 % для средних концентраций ЕС3 в диапазоне от 0,5 ЕС3 до 2,0 ЕС3, приведенных для НСА (10 %) в LLNA (см. таблицу А.1).

А.5 Межлабораторная воспроизводимость

Межлабораторную воспроизводимость нового или модифицированного метода испытаний LLNA следует оценивать с использованием двух сенсибилизирующих веществ, которые четко охарактеризованы в LLNA. Поэтому PS LLNA основаны на вариативности результатов испытаний НСА и 2,4-динитрохлорбензола (DNCB) в разных лабораториях. Значения ECt должны быть получены в независимых исследованиях, проведенных не менее чем в трех разных лабораториях. Чтобы продемонстрировать приемлемую межлабораторную воспроизводимость каждая лаборатория должна получить значения ECt от 5 % до 20 % для НСА и от 0,025 % до 0,1 % для DNCB, что соответствует диапазону средних значений концентраций ЕС3 от 0,5 ЕС3 до 2,0 ЕС3, приведенных в таблице А.1 для НСА (10 %) и DNCB (0,05 %).

Таблица А.1 - Рекомендуемые эталонные вещества для PS LLNA

Наименование вещества 1)	Номер CAS	Физическое состояние	Растворитель 2)	ЕС3, % 3)	Число исследований 4)	Диапазон -	Фактический диапазон ЕС3	LLNA для морской свинки	LLNA для человека
2-Метил-5-хлоризотиазолинон-3 (CMI)/2-метил-4-хлоризотиазолинон-3 (MI) 5)	26172-55-4/2682-20-4	Жидкость	DMF	0,009	1	0,0045-0,018	NC	+/+	+/+
Динитрохлорбензол (DNCB)	97-00-7	Твердое вещество	АОО	0,049	15	0,025-0,099	0,02-0,094	+/+	+/+
4-Фенилендиамин	106-50-3	Твердое вещество	АОО	0,11	6	0,055-0,22	0,07-0,16	+/+	+/+
Хлорид кобальта	7646-79-9	Твердое вещество	DMSO	0,6	2	0,3-1,2	0,4-0,8	+/+	+/+
2-Метокси-4-пропенилфенол (изоэвгенол)	97-54-1	Жидкость	АОО	1,5	47	0,77-3,1	0,5-3,3	+/+	+/+
2-Меркапто-бензотиазол	149-30-4	Твердое вещество	DMF	1,7	1	0,85-3,4	NC	+/+	+/+
Цитраль	5392-40-5	Жидкость	АОО	9,2	6	4,6-18,3	5,1-13	+/+	+/+
Гексилкоричный альдегид (НСА)	101-86-0	Жидкость	АОО	9,7	21	4,8-19,5	4,4-14,7	+/+	+/+
Эвгенол	97-53-0	Жидкость	АОО	10,1	11	5,05-20,2	4,9-15	+/+	+/+
Фенилбензоат	93-99-2	Твердое вещество	АОО	13,6	3	6,8-27,2	1,2-20	+/+	+/+
Коричный спирт	104-54-1	Твердое вещество	АОО	21	1	10,5-42	NC	+/+	+/+
Имидазолидинил-мочевина	39236-46-9	Твердое вещество	DMF	24	1	12-48	NC	+/+	+/+
Метилметакрилат	80-62-6	Жидкость	АОО	90	1	45-100	NC	+/+	+/+
Хлорбензол	108-90-7	Жидкость	АОО	25	1	NA	NA	-/-	-/*
Изопропиловый спирт	67-63-0	Жидкость	АОО	50	1	NA	NA	-/-	-/+
Молочная кислота	50-21-5	Жидкость	DMSO	25	1	NA	NA	-/-	-/*
Метилсалицилат	119-36-8	Жидкость	АОО	20	9	NA	NA	-/-	-/-
Салициловая кислота	69-72-7	Твердое вещество	АОО	25	1	NA	NA	-/-	-/-
Дополнительные вещества для демонстрации улучшенных характеристик LLNA
Лаурилсульфат натрия	151-21-3	Твердое вещество	DMF	8,1	5	4,05-16,2	1,5-17,1	+/-	+/-
Диметакрилат этиленгликоля	97-90-5	Жидкость	MEK	28	1	14-56	NC	+/-	+/+
Ксилол	1330-20-7	Жидкость	АОО	95,8	1	47,9-100	NC	+/**	+/-
Хлорид никеля	7718-54-9	Твердое вещество	DMSO	5	2	NA	NA	-/+	-/+
Сокращения: АОО - ацетон: оливковое масло (4:1 по объему); номер CAS - регистрационный номер CAS; DMF - N,N-диметилформамид; DMSO - диметилсульфоксид; ЕС3 - вычисленное значение концентрации, необходимое для получения индекса стимуляции 3; GP - результат испытания на морских свинках [24]; НСА - гексилкоричный альдегид; LLNA - результаты оценки локальных лимфатических узлов по настоящему стандарту; MEK - метилэтилкетон; NA - не применимо, т.к. индекс стимуляции < 3; NC - не вычислены, т.к. получены данные из одного исследования; Veh - растворитель для испытаний. 1) Растворы исследуемого вещества готовят ежедневно, если данные по стабильности не допускают возможности более длительного хранения. 2) Так как растворители потенциально способны влиять на результаты испытания LLNA, для каждого стандартного вещества следует использовать рекомендованный для него растворитель [24], [32]. 3) Среднеарифметическое значение в тех случаях, когда доступно более одного значения ЕС3. Для веществ, не давших ожидаемого результата (т.е. с индексом стимуляции < 3), приводят самую высокую из проверенных концентраций. 4) Число исследований LLNA, в которых получены данные. 5) Имеется в продаже как Kathon CG (CAS N 55965-84-9), который является смесью указанных компонентов CMI и MI в соотношении 3:1. Относительные концентрации каждого компонента в препарате Kathon CG варьируют от 1,1 % до 1,25 % для CMI и от 0,3 % до 0,45 % для MI. Неактивные компоненты - соли магния (от 21,5 % до 24 %) и нитрат меди (от 0,15 % до 0,17 %), остальные 74 % - 77 % - вода. Kathon CG можно приобрести через Sigma-Aldrich или Rohm & Haas (в настоящее время корпорация Dow Chemical). * Предположение о том, что данное вещество не является сенсибилизирующим агентом, основано на факте отсутствия положительных результатов клинических кожных проб, отсутствии данного вещества в списках стандартных аллергенов и клинических случаев сенсибилизации у людей. ** Данные (GP), полученные на морских свинках, не доступны.